Alexa Fluor 488 Phalloidin

基本信息

简介：鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd= 20 nM）选择性结合于丝状肌动 蛋白 F-actin，而不会与单体肌动蛋白 G-actin 结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的 F-actin，从而对 F-actin 进行定性和定量分析。另 外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量 比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约 12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I 等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。
鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发 生的临界浓度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制 F-actin 的 ATP 水解活性。
本品为 SuperFluor488 标记的鬼笔环肽，染色反应特异性强，对比性高，具有比 Actin 抗体更好的染色效果，适合用作 F-actin 的定性和定量检测。另外，经本品结合后的 F-actin 仍能维持 actin 自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。本产品是冻干粉形式。

操作步骤
1．染色液的配置
1) 母液的配置：使用前将本品回温至室温并简短离心，加入 30uL DMSO 使其充分溶解，混匀即可获得 1000×SuperFluor488 标记鬼笔环肽母液。根据实验 情况，对其分装并于-20℃避光干燥保存。
2) 工作液的配置：吸取 1 µL 以上 SuperFluor488 标记鬼笔环肽母液至 1 mL PBS（含 1%BSA）缓冲液中即可得到 1×工作液。
【注】：不同的细胞染色情况不同，相应 SuperFluor488 鬼笔环肽使用量也需根据不同情况而定。
2. 染色步骤
1）细胞爬片生长>24h，使其密度达到 50~60%汇合度。
2）吸掉培养液，37℃预热的 1×PBS（pH 7.4）清洗细胞 2 次。
3）使用溶于 PBS 的 4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定 10~30min。
注意：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。
4）室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10min。
5）室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化处理 5min。
6）室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10min。
7）取 100µL/孔（96 孔板）配制好的 SuperFluor488 标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育 30min（通常情况下，4℃~37℃孵育皆 可）。
注意：为了降低背景，可于 SuperFluor488 标记的鬼笔环肽工作液内加入 1% BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器 内。
8）用 PBS 清洗盖玻片 3 次，每次 5min。
9）使用 100 µL/孔（96 孔板）即用型 DAPI 溶液（浓度：100 nM）对细胞核进行复染，约 30s。
10）用 PBS 清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。 此法制备的标本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 个月内可继续做 F-actin 染色分析。
11）荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择 FITC 激发/发射滤片（Ex/Em=496/516nm）和 DAPI 激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）。

运输条件：2~8℃运输