问题解答

荧光素酶试剂盒酶标仪检测的设置条件是什么？

需要选择化学发光模式，全波长扫描，无需设置特定波长。

荧光素酶试剂盒检测范围?

是在转录水平上的检测。

荧光素酶试剂盒可以用于植物吗？

理论上可以的，植物有细胞壁，建议使用闪光型如MA0518进行，裂解的更充分，更适合。或者如选用其他辉光型产品，可以搭配我司MA0523萤光素酶报告基因细胞裂解液（通用型）使用。

荧光素酶试剂盒MA0518做植物叶片使用方法

叶片组织（以烟草叶片为例，以下仅供参考，具体可结合实际情况优化最佳检测条件）
1）构建相应的载体。
2）挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到2 mL LB液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃ 220 rpm培养过夜。
3）农杆菌培养至OD₆₀₀为1.0，1700× g离心5 min收集菌体后，用1/2MS液体培养基清洗菌体2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将农杆菌的OD₆₀₀调至1.0。
4）将待检测的农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的OD₆₀₀为0.5。
5）选取生长期为1个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上, 以保证相同的生长背景。
6）正常温室生长条件下，24-48 h即可取样观察。
7）取3-4片直径为6-8 mm的叶盘，放入2 mL的 EP 管（提前放入3-4个小钢珠）中，液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。
8）室温下静置或振动摇晃裂解15min左右，充分裂解叶片。
9）10000-16000 rpm离心1 min，取上清。后续按照说明书方法进行操作检测。

荧光素酶试剂盒使用检测出现荧光值过高或过低如何解决？

①荧光值过高可通过以下方式尝试解决：减少质粒转染量；细胞样品裂解后，离心取上清后可适当稀释后检测。注：不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。②若检测到的荧光值比较低或无荧光值，可从样品裂解效率、转染效率、检测过程等这几方面进行考虑。1）启动子活性低a.优化细胞的培养条件，提高萤光素酶的表达量；b.更换强启动子（如SV40、CMV）。2）转染效率低a.优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达荧光蛋白质粒）；b.确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定；c.选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。3）样品裂解效率低a.细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解；b. 加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。4）检测过程操作不规范a.选择合适的检测仪器，如Luminometer 发光计、多功能酶标仪或者其他能够检测生物发光的仪器都适用于该实验；b.需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差；c.室温反应。酶促反应对温度较为敏感，反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温（20-25℃）再使用；d.加完底物后可立即检测，尽量在半衰期时间内完成；e.检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光黑色/白色酶标板。5）底物氧化失效a.底物避光密封保存，按照说明书条件保存各个组分；b.反应工作液建议现用现配。

荧光素酶试剂盒使用检测出现复孔重复性差的可能有哪些？

报告基因检测实验受多种因素影响，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。除了引入另一个报告基因作为内参照避免实验条件变化的干扰之外，一般还需设置3个复孔。想要得到一个准确的结果，应尽可能减小复孔之间的差异性。1）细胞裂解后建议离心取上清，保证样本的均一性。2）保证加样的准确性，移液器需定期校准，确保移液精准。注：萤光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，复孔之间的数值有一定差异是正常的，一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。

荧光素酶试剂盒使用，如何判断实验体系无异常，获得客观的实验结果？

可以从以下几个方面来考察实验结果的客观性：1）对照的2个实验组，即实验组1与实验组2 luc表达情况应无显著差异。2）转染正常，质粒或mimic确保成功转染入细胞。3）luc检测值在仪器检测线性范围内。

荧光素酶报告基因检测实验中，如何判断转染成功？

1）如转入的miRNA带荧光标记如GFP，则可直接在转染后、细胞裂解前，显微镜下观察细胞荧光。2）如转入的miRNA不带任何荧光标记，可考虑进行miRNA的qRT-PCR检测，通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组miRNA有显著过表达。3）设置一个荧光质粒转染参照组，同批转染一个组的细胞，间接反映出同批次实验的转染情况。

GFP的绿色荧光会影响以萤火虫为底物的荧光吗？

不会干扰。以双萤光素酶报告基因检测试剂盒（MA0518)进行举例，其中萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，波长540-600nm，一般检测时选用560nm。海肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光，波长460-540nm，一般检测时选用460nm。不同于绿色荧光蛋白（GFP）需要一定的光激发才能发光，且易淬灭；荧光素酶经过反应本身就可以自发荧光，并且只有在底物存在时才能发光。因此GFP只能用于标记或检测反应是否发生，而荧光素酶报告实验却能通过荧光值定量分析荧光素酶的表达水平。

如何选择单报告基因和双报告基因？

单报告基因检测实验可能会受到细胞活性、细胞数量和转染效率等因素的影响。双报告基因通过共转染的“对照”作为内参，可以在最大程度上减小这些影响，使数据结果更可信。

萤光素酶报告基因检测主要有哪些用途？

可用于启动子结构分析、启动子SNP分析、验证特定转录因子同其调控序列的作用、分析信号通路是否激活、验证microRNA的靶序列等。

如果实验海肾萤光素酶是主报告基因，萤火虫萤光素酶是内参基因可以使用MA0518吗？

也可以使用的，实验结果归一化处理时用海肾萤光素酶萤光强度/萤火虫萤光素酶萤光强度即可，实验操作方法类似的。

荧光素酶报告基因检测实验，用什么板子检测？

不能用全透明的细胞培养板，用不透光的白板或者黑板，或者可以底部透光，四圈不透光，不然干扰读值

萤火虫和海肾双萤光素酶检测试剂盒哪款的灵敏度最好

MA0518灵敏度高

MA0519,PWL110,PWL213区别是什么？

MA0519是三款产品里面荧光相对低的，但是半衰期较长可达2小时；PWL110荧光三款里面居中的，半衰期可达1个小时；PWL213是三款里面荧光最强的，半衰期只有半个小时

MA0518和MA0520区别是什么？

MA0518荧光很高，能达到10^6，但是半衰期短，只有30S，所以适合有高通量进样器的客户，或者用排枪加一排测一排；含裂解液，需要先把细胞裂解，之后转移到96黑色板子检测，MA0520辉光型，荧光没有那么高，大概10^4-10^5，但是半衰期能达到2小时，适合高通量做很多样本的客户，可以一起加一块96孔板整体检测也行，不用非得有进样器，可以原位直接检测,,不单独加裂解液，如果有不透光的细胞培养板的话，如果没有也可以转移检测

荧光素酶报告基因系列产品怎么选择？

首先需要确认做单酶还是双酶；其次需要确认质粒；单酶我司有1.Firefly 单酶，货号分别为MA0519,PWL110,PWL213；区别是：MA0519是三款产品里面荧光相对低的，但是半衰期较长可达2小时；PWL110荧光三款里面居中的，半衰期可达1个小时；PWL213是三款里面荧光最强的，半衰期只有半个小时；2.Renilla 单酶，货号分别是：MA0524,MA0525,MA0526;区别是：MA0524是三款产品相对荧光最低，半衰期最长可达1小时；MA0525是三款里面荧光最强的，半衰期只有3-5min；MA0526是荧光居中，半衰期可达15-20min；3.Nano 单酶，货号：MA0521
，PWL208；区别PWL208质检更严格；4.Gaussia单酶，货号为：PWL210，PWL211，PWL212；区别：PWL211是三款产品相对荧光最低，半衰期最长可达2小时；PWL212是三款里面荧光最强的，半衰期只有1.5min；PWL210是荧光居中，半衰期可达1h；双酶:1.Firefly/Renilla 双酶,货号：MA0518和MA0520,区别：MA0518荧光很高，能达到10^6，但是半衰期短，只有30S，所以适合有高通量进样器的客户，或者用排枪加一排测一排；含裂解液，需要先把细胞裂解，之后转移到96黑色板子检测，MA0520辉光型，荧光没有那么高，大概10^4-10^5，但是半衰期能达到2小时，适合高通量做很多样本的客户，可以一起加一块96孔板整体检测也行，不用非得有进样器，可以原位直接检测,,不单独加裂解液，如果有不透光的细胞培养板的话，如果没有也可以转移检测；2.Nano/Firefly 双酶，货号：MA0520,PWL209,区别PWL208质检更严格

MA0520试剂盒中没有裂解液么？

不需要单独裂解，可以原位做；不过不是没有裂解液，裂解液在试剂盒第一个组分里，直接按照说明书操作就行

MA0520试剂盒做检测时候，如果没有细胞专用的黑色板子，可以用正常细胞培养板？

可以的，细胞正常在细胞培养板里面养即可，但是检测的时候要转移到黑色板子，不然透明板子会有荧光干扰

MA0518和MA0520报告基因试剂盒中的stop buffer组分能通用么？

stop buffer组分不能混用，不一样，配方不一样

产品说明书和质检报告等资料如何获取？

A、发货时会将产品说明书和质检报告以纸质版形式与产品共同寄出。 B、可以在官网 (https://www.meilunbio.com) 相关产品的相关文档页面中下载。 C、可致电 0411-66771945，或发送邮件至 sales@meilune.com向客服人员索取。

产品的储存条件是什么？

产品标签上会明确标明具体的储存条件，说明书上也会写明具体的注意事项。以下是一些 常规 抑制剂产品的储存方法：固体粉末： -20°C 3年。溶液： -80°C 3-6个月； -20°C 1-3个月 (避免反复冻融，以免影响活性)；对于特殊产品，请参照说明书中该产品的储存条件。

产品配制或使用前需要怎样处理？

在产品运输过程中，粉末或溶液可能会附着到管壁或管盖上。所以，建议开封前使用离心机低速离心，从而减少产品的损失。

在细胞实验中产品应该如何稀释？

用 ddH2O 作为溶剂配制的母液，可以直接用培养基稀释到所需的工作液浓度。
用 DMSO 作为溶剂配制的母液，在稀释时要确保工作液中 DMSO 的终浓度尽量在 0.3% 以下，最高不要超过 0.5% ，并设置相应浓度的 DMSO 对照组。 稀释过程建议分段进行，避免浓度变化过快导致化合物析出。若稀释过程中出现化合物析出的情况， 可采用37-50度加热超声的方法使其复溶。

在动物实验中如何使用产品 (如给药途径、剂量、溶剂以及给药周期等) ？

用 ddH2O 配制的母液，可以直接用生理盐水或 PBS 缓冲液稀释到实验所需的浓度。
用 DMSO 配制的母液，也可以用生理盐水或 PBS 稀释，为减少对动物的毒性，建议 DMSO 的终浓度不要大于 5% 。有些产品在水中的溶解度很低，DMSO 配制的母液在稀释过程中可能出现析出的情况，可以通过添加助溶剂来帮助溶解，比如 Tween80 、甘油、羧甲基纤维素钠和 PEG400 等。悬浊液可用于口服和腹腔注射，不会影响产品活性。
备注：在产品详情页面会提供文献中使用的溶解和给药的方式，并不是美仑实际测得的结果，不保证其有效性，仅供参考。

产品是否无菌？

产品粉末多为非无菌粉末，溶剂多用DMSO配制，由于 DMSO 本身具有极强的杀菌力，配制好的溶液为无菌溶液，只需保持操作环境及仪器无菌即可。若确实需要除菌，建议使用0.22um过滤器，切勿高温高压灭菌。

细胞实验：给药剂量到底如何确定？

不同的产品，不同的给药方式和给药剂量，即使是同一产品，不同的细胞，不同动物模型，给药剂量也是不一样的。拿到产品后，我们要根据产品名字和自己的实验设计，有目的的去查文献。

细胞实验，剂量如何查询

细胞实验一般是将小分子药物加入培养基，与细胞共孵育来发挥作用的。输入产品名字，细胞系名称，剂量单位(小分子抑制剂一般用量在 µM 的比较多，重组蛋白类的一般用量在 ng/mL 的范围)，文献搜索后，参考文献的使用浓度和使用时间，设计自己的实验。
Tips: 也会有小伙伴遇到自己的细胞系没对应文献的情况，建议根据其他细胞系文献的使用剂量，设置梯度进行 “剂量-效应” 曲线预实验，确定合适的使用浓度再进行后续的功能研究。

动物实验：给药剂量如何确定？

动物实验的给药方式包括口服，灌胃，注射 (皮下注射，皮内注射，静脉注射，腹腔注射，肌肉注射等)，在动物实验给药之前，首先明确自己的实验动物和实验模型，再用关键字查阅文献选择合适的给药方式进行实验设计。
在查阅文献的网站搜索框中输入产品名称，动物模型，剂量单位(小分子类产品一般 mg/kg 较多)，搜索文献，搜到文献后参考文献剂量设置梯度进行就可以啦！

查到的文献都是小鼠，但实际你要做的是大鼠，但是找不到文献支持，怎么办？

汇总好查阅的关于小鼠的给药剂量的文献。
使用常见物种给药剂量的相互换算，根据公式 Animal rat (mg/kg) = Animal mouse (mg/kg)multiplied by (Animal mouse
Km/Animal ratKm)。即大鼠体内的给药剂量为小鼠给药剂量的一半(请注意，严谨起见，设置浓度梯度剂量组)。

关于产品分装及储备液保存问题

产品分装：您收到货物后最好不要自己进行分包，因为分包环境、包装材料等因素可能导致分包后的产品变质；如您有特殊包装要求，请在订购时候与我们客服代表阐明，当然价格会做适当调整。对于开盖后，长期未使用的，请务必重新密封好，建议Parafilm封口膜，并按照相应储存条件使用。如果放置时间过长，超过产品有效期，建议您重新购买，以免影响实验质量。
储备液保存：大部分试剂的溶液形式稳定性较差，请优先采用现用现配的方式。如需制备储存液，请根据说明书选用合适溶剂，储备液制备完成后请于零下80摄氏度储存，一般可以稳定存在3个月以上。在使用前，再对储备液进行稀释。避免储备液反复冻融。

原料药和标准品的区别

主要是用途的不同。
原料药：主要是用于做成制剂，实验室可用于动物体内或体外试验（细胞试验）。
标准品（对照品）：是一个参照物，一般都是用来含量测定用的，因为是一个参照物，其更侧重含量的准确性。可以理解为准确标定过的原料药，所以也可以用于动物体内或体外试验（细胞试验）。

原料药钠盐和钾盐形式区别

有些化合物钠盐钾盐形式和原料药之间，药效基团是一样的，只不过物理性质有所改变，盐形式溶解性会更好。

有些MB产品纯度是IU/mg，不是百分之多少？

麻烦收到产品以COA内容为准，不是所有产品都是液相检测方法，有些产品是效价检测的，我们检测方法一般是按照药典检测的。

产品到了冰化了影响使用吗？

对于需要低温储存的产品，我们在运输时候都会采用冷藏包装，但是部分由于外界气温过高，运输时间较长，对于普通冷藏包装，途中可能会温度升高，这些一般是没有问题的，因为这种普通冷藏只适用于那些短期内（1周）高温依然稳定的产品，建议低温的储存条件，只是长期储存时候的条件，您可以放心使用。对于某些特殊的产品，如抗体，我们会采用干冰冷藏包装，确保全程低温。美仑公司都对产品性状进行了严格的稳定测试，行业经验丰富。

化合物等产品写着非无菌包装，用于细胞怎么处理？

灭菌方式，我们建议通过0.22μm微膜过滤方式除菌，请勿采用紫外，射线或者高温灭菌方式，否则会影响化合物活性，甚至破坏其结构导致彻底失活。

收到产品感觉包装品是空的？

如果您购买的产品的量非常小，同时有些产品在冻干的过程中粘附在管壁上形成薄薄的一层，可能观察不到产品的存在。您可以加入指定溶剂（参照操作手册）并涡旋或超声震荡使之完全溶解。
对于蜡状或油状的产品很难取出称量它们的质量，我们建议您用合适的溶剂直接溶解该化合物；对于具有吸湿性的化合物，暴露在空气中会吸收水分，呈现液滴状，这种产品需要放置在干燥器中保存。

收到化合物颜色/包装/溶解度和之前不一样？

同一产品不同批次之间存在差异，这是正常现象，麻烦以收到本次产品的COA为主。

有些产品只能用DMSO溶解，给动物DMSO还需要小于5%，怎么办？

（1）超声水浴加速溶解（2）如果是灌胃方式给动物可以混悬液（3）可以选一些助溶剂例如PEG300，吐温80等，具体方法需参考文献尝试。

部分产品单位写的g，收到产品是液体？

部分产品由于本身熔点，自身性质，就是液体状态，例如肉桂醛，常温就是液体。

同一款产品不同批次间的颜色/外观/性状等稍有差异的原因？

因为不同批次产品所用的起始原料、中间体供应商或生产工艺参数（如结晶温度、干燥速率、光照条件）可能存在微小波动，这些都可能会导致成品在颜色、性状、晶型或溶解速度上有些差异。这是试剂生产中 “合格范围内的正常批次波动”，不影响产品的药效、纯度及使用效果。每批产品我们均严格按照相关产品的质检标准进行项目检测，符合既定的产品质量标准。对于一些特殊产品存在两批性质差异变化较大的，如您需进一步确认验证，也可随时与我们联系咨询。

STZ糖尿病动物造模实验，对于动物的选择要求？

尽量选用雄性动物，雌性含有激素影响建模效率。有研究显示，雌性动物成模率差，而且可能会比雄性出现更高死亡率，尤其是I型。
I型糖尿病(Type I diabetes) 一般按照体重选择即可，推荐大鼠170-200g，小鼠17-22g，适应性喂养1~2周后空腹注射STZ，成模率相对理想。
II型糖尿病(Type II diabetes) 对于大鼠（比如SD/Wistar），选取4-5周龄，体重在90-100g，高脂高糖饲料喂养4-6周体重约达240-280g。对于小鼠（比如C57/ICR/昆明小鼠），选取4-5周龄，体重在16-20g，高脂高糖饲料喂养4-6周体重约达30-35g。对于新购入动物或更换饲养环境需要先用普通饲料适应性喂养一周，然后再选择适合周龄/体重动物转用高脂高糖饲料继续喂养。从模型建立成功率来看，大鼠推荐用SD，小鼠推荐C57。

STZ糖尿病动物造模实验，造模前都需要高脂喂养吗？

造膜前的喂养，Ⅰ型糖尿病模型成模比较快，通常大鼠在普通饲料适应性喂养2周后即可开始造模；Ⅱ型糖尿病模型：高脂饮食诱导加小剂量STZ，造模前喂以高脂高糖饲料，诱发出胰岛素抵抗。

STZ糖尿病动物造模实验，STZ－柠檬酸钠缓冲液怎么配制

A液和B液的配制：称取柠檬酸(MW: 210.14) 2.1 g加入双蒸水100 mL中配成A液；称取柠檬酸钠(MW: 294.10) 2.94 g加入双蒸水100 mL中配成B液。
柠檬酸钠缓冲液的配制：将A、B液按一定比例混合（1：1.32或1:1），调节pH值到4.2－4.5，用0.22 μm滤膜过滤除菌，即是所需柠檬酸钠缓冲液，建议现配现用。
称取STZ冻干粉，放置干燥无菌瓶中，用锡箔纸包好，置于冰上，加入预冷的柠檬酸钠缓冲液(1% w/v)溶解，用0.22 μm滤膜过滤除菌。
注意：①STZ冻干粉从−20°C冰箱取出后，室温干燥避光放置10 min左右，使其彻底解冻（很重要）。②STZ不稳定，易失活，快速称取后剩余试剂仍要求干燥避光，推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸包裹。③注射时若操作不熟练，切忌不可一次性溶解完STZ。建议根据操作熟练度，分组溶解STZ，比如10只或15只鼠/组。亦可提前将STZ按动物分组的所需量称重，分装。

STZ糖尿病动物造模实验，推荐的注射方法及注射剂量？

按动物空腹体重腹腔或尾静脉注射，与腹腔注射相比，尾静脉注射药物利用效率更高，但操作难度较大。如果注射操作技术不熟练，应两组交替注射，注射应在30 min内完毕。
Ⅰ型糖尿病模型：小鼠一次高剂量建议100-200 mg/kg，多次低剂量建议为20-50 mg/kg连续注射五天；大鼠剂量建议为40～70 mg/kg，注射一次。
Ⅱ型糖尿病模型：高糖高脂喂养1～2个月后，小鼠剂量建议70-120 mg/kg，注射一次；大鼠剂量建议在25～40 mg/kg，注射一次。
注意：实验前应进行预实验，确定合适药量，因为动物均重、空腹抗药力、禁食时间、注射手法和饲养过程皆不一样，不要盲目按照文献用药量直接进行实验。

STZ糖尿病动物造模实验，注射后需要注意什么？

注射完STZ后要给予动物足够的水、食物（糖尿病鼠的基本生活特征），需每日换垫料，保持鼠笼干燥。饲养时，注意避免强日光照射。尽可能勤消毒。
注意：STZ造模后，明显血糖水平波动呈现3个时相，一时性高血糖(1-2 h)、短暂低血糖(6-10 h)、持续高血糖(>72 h)。必须适当补给胰岛素和葡萄糖。

STZ诱导糖尿病模型建模效果评估指标

一般性指标：出现多饮、多食、多尿现象，体重下降；
其他指标：空腹血糖、空腹血清胰岛素水平、血清胰岛素水平、胰岛素敏感性、糖耐量等；
血清生化指标：T-Cho、TG、HDL-C、LDL-C、CR、BUN、Alt等；
病理切片：组织病理切片；

STZ粉末收到后，如何保存？

多次称取要严格按照避免受潮的原则操作和存放。操作方法：操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥。分装后用封口膜密封瓶口，用铝箔纸(或锡箔，即避光)将瓶子包好，放入干燥罐里（干燥剂，即保持干燥状态），并-20℃冷藏，可长期保存。

STZ溶解可否使用其他缓冲液？

可以。但我们推荐使用柠檬酸。例如用醋酸等溶液，也可以做出，但其PH值不好控制，而STZ只有在PH4.2-4.5的时候才具有最佳药力活性。

STZ注射液配制时，粉末分装需遵循什么原则？

①STZ不稳定，易失活，快速称取后剩余试剂仍要求干燥避光，推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸包裹。②注射时若操作不熟练，切忌不可一次性溶解完STZ。建议根据操作熟练度，分组溶解STZ，比如10只或15只鼠/组。③亦可提前将STZ按动物分组的所需量称重，分装。

STZ糖尿病动物造模实验，预实验非常重要吗？

很重要。实验时STZ的给药量应参照预实验的结果，尽量不要盲目按照文献上或他人的给药量来直接使用，鼠均重和空腹(低糖状态)抗药力、禁食时长、注射选时、以及之前饲养过程、测糖选时等都不相同，通过预实验来确定符合自己实验鼠的给药计量，才是最科学的。

STZ糖尿病动物造模实验，建模前，大鼠为何要禁食？

禁食12小时以上(一般过夜禁食，不禁水)。禁食的时间越长，STZ对胰岛β细胞的破坏力越明显，即药效越高。所以相对禁食时间延长，可以降低STZ的用量。

STZ糖尿病动物造模实验，注射方式对实验结果的影响？

尾部注射即静脉注射，药物利用率较高，同比腹腔注射，可以节省药量，缺点是操作起来不如腹腔注射方便。

STZ糖尿病动物造模实验，注射时，推进速度和血糖的关系？

推注的速度快，更容易形成高血糖，推注的速度慢，相对的危险性较低，但也不容易成模，常规操作中多要求快速注射。当然，STZ的剂量是决定血糖高低的主要因素。

STZ糖尿病动物造模实验，注射STZ后，模型不成功，如何处理？未达标模型如何补救？

模型不达标者，三天后补注STZ（以10 mg-20 mg/kg体重剂量腹腔注射），也很容易成模，或让血糖恢复正常后再常规剂量注射；但要达到理想的效果，往往是恢复到正常状态下重新造模。

STZ诱导糖尿病模型的失败的可能原因

1、STZ的品质差，建模用STZ纯度应不低于98%（HPLC检测）。
2、STZ失效：STZ易潮解，应干燥保存，避免受潮。粉末避免长时间室温放置，溶解的STZ非常不稳定，在中性pH值的半衰期为15 min，应现配现用。注意用酸性pH值溶解STZ，最好放在冰浴里。
3、腹腔注射是否注射到肠子等脏器。
模型不达标者，建议再观察3天，若仍不成模型，重新注射一次。

STZ糖尿病动物造模实验，STZ诱导小/大鼠死亡率高的原因解析

1、鼠的体重过低；
2、饮水量不足；
3、高血糖和低血糖都会造成鼠死亡，可以通过注射胰岛素或暂时补糖降低死亡率：
①常见为血糖过高。补胰岛素法，补一些中效胰岛素。例如给诺和灵n或NPH(中性鱼精蛋白锌胰岛素)，每次2-3个单位，3-5天后大鼠一般死亡率就低了；
②补糖法，禁食后的鼠，注射的时候已经处于低血糖状态，造模4 h后腹腔注射20%的葡萄糖，可避免因注射时血糖过低死鼠；
4、动物自相残杀。食物缺乏和供水不足的情况下，会互相撕杀、啃食同类，所以食物和饮水要供应充足，最好是两路供应;
5、感染。糖尿病大鼠尿量多，垫料潮湿，需要勤换垫料，所以糖尿病大鼠较其他大鼠容易出现感染，特别是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后，要注意消毒工作。如每次采血测血糖后可用四环素(或金霉素眼药膏)局部涂抹处理伤口预防感染。

STZ糖尿病动物造模实验，建模的影响因素

糖尿病疾病模型的影响因素包括STZ建模试剂的质量、动物状况及给药方式等。其中，试剂主要性能为纯度、稳定性、溶解特性等，动物状况主要包括遗传背景，雌雄，性别，体重，饲养环境，饮食结构等，给药方式包括给药时间、给药间隔和给药途径。差异化的因素带来差异化的建模效果。

DSS是聚合物吗？这款分子量是多少？

是聚合物，分子重量M.W:36000-50000。

DSS诱导小鼠结肠炎，造模时间需要多久？

一般结肠炎造模分急性和慢性，急性一般7-10天左右，慢性要根据实验设计可能要1个月左右，一般急性造模文献常用3-5%浓度，具体也要根据小鼠耐药性等综合来看。

DSS制备结肠炎模型中，如果出现有的老鼠不爱喝水怎么办啊？这个有解决方法吗？

这个药在水里，正常小鼠饮水要保证每天8-10ml，举例按3%给，但是只喝了一半水，就相当于只有1.5%的药效了；如小鼠喝水量少1.可以调整室内温度和干燥度等，促进其饮水，但是如果动物房不让改变条件2.可以改变给药方式灌胃，如果也不想改变给药方式3.可以把水换成专用溶剂，货号：MA0650，这个很多客户反馈用了之后小鼠就喝的多了，这个我们做了处理，里面有一些糖之类的小鼠就爱喝了4.如果也不想用这个溶剂，那就加大剂量用5%，这样他喝的少换算的话也能喝2.5%了

DSS给药结肠炎模型造膜不成功

1、不同鼠类型，造模难易程度不同，建议适当提高一下给药剂量，建议初次做个预实验，取3只鼠，浓度可以优先设置3%，或者选择几个常用的浓度梯度进行实验，一般给药5-7天会出现精神萎靡，便血等造模情况（其中大鼠和小鼠的病变主要以直肠和左半结肠为主，DSS诱导的炎症发病及严重程度与DSS浓度及动物种系有关）。
2、建议溶液现配现用，以保证其最好的药效（必须新鲜配置）。
3、保证小鼠每天饮水量大约（以250克左右SD大鼠为例：饲料30-45克，水40-60毫升；以25克左右CD-1小鼠为例：饲料5-10克，水8-15毫升，当然这些与饲养环境，饲料成分等不同在各实验室应该稍有差异）咱们实验一般小鼠饮水量是10ml左右，2只一笼。如小鼠喝水量少，可以提供室内温度和干燥度
4、保证饮水瓶避光（BALB/c 对DSS的敏感度不如C57（小鼠常用品系C57背景纯，诱导肠炎更稳定。使用Babl/c小鼠时，要做好预实验；大鼠常用品系SD和Wistar）

DSS制备结肠炎模型中，小鼠出现便血没几天就死了，来不及治疗。

考虑可能是给药剂量对于这批小鼠来讲太高了，导致炎症比较严重，建议降低些给药浓度剂量，预实验看下比较合适的作用浓度。

DSS制备结肠炎模型，做大鼠会不会不成功？

我们验证是用的小鼠，大鼠的话理论上是可以的，有文献报道，可参考我司客户发表文献。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34104893/

DSS诱导小鼠结肠炎实验，DSS配置的水溶液，刚开始没事，后来就浑浊了，怎么回事？怎么避免？

可能是污染了；鼠饮水可能会带进去细菌，就容易污染，另外注意避光，DSS水容易稳定性不太好，所以我们建议是每天都换新的。

DSS制备结肠炎模型，你们自己造模的时候会死么？然后一般几天能出现症状，解剖之后可以用肉眼看出来明显区别么？

也会死，因为小鼠有个体差异，而且这个模型是自由饮水，小鼠喝多少也不太可控，如果预实验喝水特别多死亡多，你就减少点浓度或者改变下生存环境，解剖一般肉眼看不太出来，因为不是癌症模型，就是炎症，需要做HE病理切片；一般3-4天就能看出来症状比如便血，如果浓度低可能得5-6天。

DSS制备结肠炎模型，大鼠用量有参考么？

4-6%，大鼠自愈能力比较强，请客户先做个预实验看看。小鼠3-5%。饮水瓶避光，每天更换新鲜配置的DSS溶液，保证饮水量，小鼠每天8-15ml，大鼠每天40-60ml。

DSS诱导小鼠结肠炎，可以用balbc小鼠吗？balbc小鼠的急性溃疡性结肠炎所用的dss浓度是多少？

BALB/c 对DSS的敏感度不如C57（小鼠常用品系C57背景纯，诱导肠炎更稳定。）使用Babl/c小鼠时，要做好预实验。给药范围3%-5%，但是比较看小鼠的特异性和个体差异，只能做预实验，然后调整使用剂量这样，比如先做两只，看一下效果，一般给药5-7天会出现精神萎靡，便血等造模情况。

DSS制备结肠炎模型，急性肠炎给药最多能几天？

急性造模3%-5%饮用7天左右。一般不超过10天。

DSS可以用于体外实验细胞么？

这个产品多数做动物试验，找了一些文献都是做动物试验的，细胞试验的浓度不同细胞系也不同，您可以根据自己试验做个浓度梯度筛选一下。我公司实验室没用于体外实验过，无法提供参考。可以看一下参考文献。

DSS是不是细胞培养级别的 有细胞培养级别的不啊？

不是无菌的，非无菌包装，要过滤除菌。

DSS的高分文献有吗？

可在官网查询，产品页面的文献引用中，收集了我司客户发表的高分文献。

DSS诱导动物结肠炎，斑马鱼可以吗，怎么做?

我司只测试过诱导小鼠的模型，未验证过鱼的，不过有客户使用我家DSS产品诱导鱼的模型，可供参考：实验方法参考3dpf（days post fertilization) 斑马鱼
1、将斑马鱼胚胎培养在含甲基蓝的E3胚胎培养基中，28.5 ℃，培养至1 dpf；
2、1dpf 后使用不含亚甲基蓝的E3胚胎培养基，培养至3 dpf；
3、用E3培养基配制浓度为10% DSS的储存液;
4、用培养基稀释DSS至最大非致死剂量（DSS浓度参考：0.5%）；
5、用0.5%的DSS处理斑马鱼，从3 dpf处理到6 dpf，观察指标
以上仅供参考

DSS和TNBS结肠炎造模剂有什么区别啊

葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium, DSS）和三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene Sulfonic acid, TNBS)诱导的结肠炎动物模型都属于化学物诱导的IBD模型，但两者在发病机制、病理表现、造模方法和病程特点、适用范围等方面均有所不同。
发病机制：DSS是由蔗糖合成的硫酸多糖体，其诱导大鼠结肠炎的机制可能与通过各种途径造成T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等激活，引起细胞因子表达改变，导致肠上皮屏障破坏有关。而TNBS是一种有机弱酸，属半抗原，单独在体内不能诱导免疫应答，目前认为其主要致炎机制为：乙醇破坏肠黏膜屏障后TNBS渗入结肠组织，与大分子物质结合形成全抗原，引起肠黏膜的一系列免疫和炎症反应，随着组织的逐渐修复，可出现肠壁增生性改变。DSS结肠炎急性期以Th1-Th17型免疫反应为主，慢性期主要为Th2型免疫反应，TNBS结肠炎的Th1-Th17型免疫反应则在慢性化过程中逐渐增强，两种模型的细胞因子谱存在显著差异。
病理表现：DSS结肠炎表现为浅表性、局灶性炎症和溃疡，全结肠均可发病，炎症主要累及黏膜层和黏膜下层。TNBS结肠炎为全层性炎症和溃疡，偶见肉芽肿形成，炎症累及肠壁全层。
造模方法和病程特点：将DSS配制成水溶液，加入饮水中予实验动物自由饮用即可建立DSS结肠炎模型，急性模型制作简便易行，重复性好；反复予DSS刺激则可诱导实验动物出现结肠炎急性期与缓解期交替出现的变化，与人类UC病程相似，但耗时较长(需2个月左右)，费用较高。TNBS结肠炎模型以灌肠方式建立，炎症持续时间长。
适用范围：两种模型均可用于溃疡性结肠炎（UC）发病机制和治疗药物的研究，但TNBS模型则更适用于克罗恩病（CD）的相关研究。

DSS溶解之后发黄是正常现象吗？

DSS溶液透明-淡黄色都是正常的。

3%浓度DSS怎么配置的

称取3g粉末溶解于100ml纯水中

DSS溶液是否可以高压灭菌？

不可以，会导致DSS的分子结构发生变化。

DSS可以用超声进行溶解吗，会破坏其分子结构吗？

DSS易溶解，无需超声即可溶解。如果必须使用超声，也是可以的。

DSS造模期间是否可以进行不同时间点的检测，观察DSS饮用前期什么时间会造成上皮屏障破坏？

可以，一般2天造成上皮屏障破坏，可以选择3、5、7天；进行病理检测。

用DSS处理肠癌细胞，请问DSS也是无菌水溶解吗？

建议用无菌水配成母液，0.22 μm滤膜过滤后加到培养基中或者用培养基直接溶解，再经0.22 μm滤膜过滤。

DSS诱导小鼠结肠炎模型实验，有没有一个标准可以评定造模成功了呢？比如是疾病活动指数DAI评分还是用试剂盒检测出粪便潜血就可以了？

体重减轻、稀便、腹泻、血便或粪便潜血、溃疡，组织学变化评分为上述各指标之和，在急性结肠模型中淋巴结形成不做评分。组织学分析的标准方法为HE染色

DSS结肠炎造模中，HE染色取结肠的哪一部分更可靠？

小鼠肛门往上1-2 cm

DSS结肠炎造模中，除引起结肠损伤，还会引起肝脏，脾脏损伤吗？

DSS除导致肠道损伤外，会加速非酒精性肝硬化的进展，部分客户偶尔发现对正常动物的肝脏也会有损伤，但对脾脏的损伤未见有报道。

DSS诱导小鼠结肠炎模型实验，C57小鼠，3% DSS喂食7天后，体重只下降了1 g，无便血等其他症状。原因是什么？

首先，体重下降程度只是造模成功与否的参考因素之一。小鼠体重下降不明显，但也有可能造模成功，需依据病理切片来判断。DSS有批间差，并且小鼠具有个体差异，文献中DSS浓度1-5%都是存在的，是要看造模成功与否而不是使用的DSS的浓度。建议进行预实验来选择合适的DSS浓度。
注意事项：
a建议溶液现配现用，以保证其最好的药效，如果天数多不更换，可能就失效了。或者使用我司DSS专用溶剂进行溶剂配置，可增强其稳定性，配制DSS溶液后在37℃可以稳定保存2周，2~8℃可稳定保存一个月以上。
b保证小鼠每天饮水量，一般小鼠饮水量8-10ml左右，2只一笼。如小鼠喝水量少，可以调整室内温度和干燥度；
c保证饮水瓶避光，产品见光容易分解；

急性肠炎 DSS 造模，3% 小鼠喂食7天， PCR没有检测到炎症因子，什么原因？

DSS会抑制PCR反应，建议DSS肠炎模型在做PCR反应的时候加入阳性对照，排除DSS对PCR的抑制。阳性对照采用相同的模板，用gapdh的引物来做PCR。或有文献使用精胺可以去除DSS对PCR的抑制。参考文献：Journal of Microbiological Methods ，2018 Jan, 144: 1-7。

DSS诱导小鼠结肠炎模型实验，从DSS诱导小鼠的粪便样本中提取DNA，结肠组织中提取的RNA中会有DSS残留，会抑制下游PCR，RT-PCR实验，如何处理？

精胺可以去除DSS对PCR的抑制。参考文献：Journal of Microbiological Methods ，2018 Jan, 144: 1-7

DSS诱导小鼠结肠炎模型实验，现在用2.5%和3%浓度DSS结肠炎造膜都不成功。半年前我用来做是可以造模成功的。这次就不行了，所以想问一下是什么问题？

使用DSS 诱导肠炎模型实验需要注意的事项如下：1.小鼠体重：建议按照周龄来选择，推荐8-12周小鼠，体重约22g。2.个体差异：尽量选取亲代差异小的小鼠；将小鼠混杂，减少组间差异；购买动物后在实验室先饲养1-2周后再进行实验。3.药液配置：DSS 要现用现配；每1~2天更换一次DSS水溶液，建议每天检查小鼠饮水瓶，观察小鼠饮水量。或是配套使用我司DSS专用溶剂（MA0650），简化操作方便使用，造模效果更佳。4.药品批间差：DSS是葡聚糖聚合物，分子量是平均分子量，每个批次之间会有分子量的差异，而分子量对肠炎造模有影响。通常DSS批间差比较稳定，但是也有少部分批次存在批间差较大的现象，建议客户根据自己实验需求，购买足够的同一批次产品。如果实验条件更换了DSS批次，建议在更换批次前先进行预实验，小鼠无肠炎症状或低肠炎症状，可适当升高DSS给药浓度。5.饲养环境：每笼饲养的动物不要过多，建议2-3只/笼，避免部分小鼠没有/少量饮用DSS；不要频繁更换饲养笼。

DSS诱导小鼠结肠炎模型实验，为什么不同批次的DSS使用浓度会有差异？

DSS是葡聚糖聚合物，分子量为平均分子量，每个批次之间会有分子量的差异，而分子量对肠炎造模有影响。通常DSS批间比较稳定，但是也有少部分批间差会大一些，所以建议客户根据自己的实验需求，购买足够的同一批次产品，或者换用批次之前进行预实验。

DSS诱导小鼠结肠炎模型实验，为什么同一笼的小鼠出现的症状有差异？

动物之间存在个体差异，不同的动物饮水量可能不同，而且不同的动物对DSS的耐受性也不同。

DSS诱导慢性结肠炎的方法

常用方法：自由饮水，2%DSS 5天 + 3 天水，反复 3个循环 ，因动物种类和个体差异会有影响，建议可参考以上进行摸索预实验优化

DSS诱导小鼠结肠炎模型实验，为什么慢性肠炎模型的第二个周期饮用相同浓度的DSS，动物出现的症状没有第一个周期明显？

动物饮用DSS一段时间后会有耐受性，所以第二个周期出现症状减弱为正常现象。

急性肠炎 DSS 造模，小鼠致死率高

原因：DSS浓度太高。建议：适当降低DSS给药浓度

DSS相关的试剂有推荐吗？

有的，看下这两款可以搭配使用:货号: MB5535
名称: 葡聚糖硫酸钠盐结肠炎造模用DSS
货号: MA0650
名称: DSS专用溶剂用于肠炎造模

DSS诱导急性结肠炎灌胃方法可以么？有protocol？

可以。Protocol 如下（仅供参考）：
每天分别于 10:00,14:00 和 18:00 给予 2% DSS 溶液灌胃，每次 30ml/kg，不另予饮水。每天末次灌胃后给予足量混合配方颗粒饲料，次日 8:00 取走饲料。造模时间 9 天。参考文献：葡聚糖硫酸钠自由饮用与定量灌胃诱导小鼠急性结肠炎模型的比较研究，胃肠病学 2009，14（1），27-30。

TNBS产品中，5%是含多少g的TNBS

5%是50mg/ml ，10ml里面就是500mg。

结肠炎诱导剂TNBS,浓度5%w/V(Meilunbio)是无菌的么

是的，无菌的

TNBS急性结肠炎造模得几天呀，慢性呢？

一般急性的话7-10天，慢性一般3-4周左右

TNBS小鼠急性结肠炎造模，死亡率过高

1.术前禁食24小时，自由饮水2.轻微麻醉，c57小鼠用麻醉导管经肛门插入8CM左右3.快速注射100mg/kg TNBS乙醇溶液。可能是位置没找对，可以4天以后解刨小鼠做下病理看看；动物实验不可控因素很多，死亡现象也有可能是因为断食后BABC小鼠抵抗力低下，或饮水不均匀造成的。小鼠个体差异也很大，需要进行给药浓度摸索。而且小鼠对这个药敏感性低，不容易造模成功，计量太大还容易死亡，所以小鼠用TNBS可以先做致敏实验，但安全剂量需要自己摸索，可以先从小一点开始，然后每一周剂量增加一些，或者也可以做不同浓度的直接注射，比如75mg/kg，100mg/kg，125mg/kg。

两款TNBS（MB5523/MB5547）的区别是什么？

MB5523，为TNBS的水溶液，专门用做IBD动物造模。浓度为1M。每只含TNBS为0.293克。取 1M TNBS 溶液 1ml+双蒸水 4.86ml，涡旋混匀， 即得5% TNBS溶液, 0.22um过滤,避光、4℃放置备用。两者药品作用方向等一样的，提供的浓度不同，可以根据实验需求进行选择。

TNBS产品溶液中，里面除了TNBS还有其他物质吗

本品为TNBS的水溶液。

配制在乙醇中的TNBS可以储存多久？还是要现配现用？

我们建议现配现用，当天内使用。

TNBS配置好的工作液，在4℃放一晚上可以吗？

tnbs的工作液现用现配，里面有乙醇容易挥发。

TNBS可以用于斑马鱼的造模么？

理论上可以，也有我司客户发表过此方向文献。剂量建议客户参考一下文献，做一下预实验摸索一下。

mb5523和mb5547 哪个浓度高一点

MB5547浓度高于 MB5523， 5%W/V换算完相当于170.55mM MB5547是1M的 换算完相当于29.317% W/V。

TNBS产品保质期多久

按照说明书储存，一般2年。

TNBS结肠炎造模成功7天后，大鼠有点自愈情况。

理论上是的，因为停药后，大鼠自身免疫细胞也在恢复自愈，有一定结肠炎缓解的趋势，但此药物造模情况还是比较明显的，理论上给了治疗药物后会比对照组恢复的更好的，会有一定组间趋势。

TNBS结肠炎造模动物给药方法？

举例：Wisatar 大鼠，术前禁食24小时，自由饮水，麻醉，用导管经肛门插入8CM左右，深达结肠，然后匀速缓慢给药注射100mg/kg的TNBS乙醇溶液（配置方法可参考官网https://www.meilunbio.com/product/mb5523/）

TNBS结肠炎造模动物注意事项

a禁食时间：禁食24h，麻醉给药前用棉签刺激肛门，促进排除末端肠道内粪便。
b动物麻醉深度：需要深麻醉，即动物对疼痛刺激无反应才好。
c药物浓度：高浓度药物对肠道的刺激更重，容易引起药物外溢。因此采用无水乙醇与生理盐水结肠灌注，就极少有外溢现象。即结肠给药的TNBS溶液中主要包括三个成分：TNBS，乙醇和生理盐水。
d给药速度：给药时要匀速缓慢给药，避免引起肠道反射。
e 给药体积：大鼠0.5-1.2ml，小鼠应该0.05-0.2ml左右。
f 灌肠后保持肛门高位1-5min，防止药物流出。

TNBS结肠炎造模给药之后，鼠肠道出现梗阻

TNBS相对于来讲更适合大鼠造模，对小鼠的毒性相对大些，可能会出现肠梗阻或者其他病变或者致死等情况，建议预实验调整摸索下给药浓度。

TNBS结肠炎造模的工作液怎么配置？

2% TNBS 溶液的配制：取 5% TNBS 溶液 2ml+无水乙醇 2ml +生理盐水 1ml.涡旋混匀,即得2% TNBS溶液(含乙醇40%) , 0.22um过滤,避光、4℃放置备用。

可不可以反复麻醉？

我们这边做过如下测试：同一只鼠，隔几天再麻醉，做了4次，状态和其他方面没有异常。

阿佛丁跟异氟烷差不多吗？可以直接替代吗？

异氟烷是吸入式麻醉剂，操作简单，但是麻醉时间上很短，也就5-10min，所以如果造模时间长的话可能不太合适，阿佛丁是注射式麻醉剂，操作上麻烦一些，得注射，但是会使动物进入浅睡眠状态，短时间内不会苏醒，而且麻醉的安全性相对较高；由于方式不一样，不能通用哈，但是对于麻醉上是可以替代这个作用的。

阿佛丁，咱家打5-6ml？这么多么？是咱们自己试过的么？

推荐剂量确实是咱们自己试过的，需要这么多，不然鼠不倒，这些计量鼠不会死，或者客户也可以自己摸索浓度

阿佛丁可以麻醉致死吗?

麻醉剂量大会导致死亡，但是不同品系动物药物敏感度肯定有差别，个体差异也会有，所以没做最大致死量，不建议超过30ul/g，30ul/g麻醉后小鼠5min内完全麻醉，维持时间如果不够，就是实验没做完，可以腹腔再补100μl左右，但不建议一开始就提高给药剂量，除非预实验结果显示给药剂量必须超高30ul/g。

阿佛丁需要稀释使用吗？

不用稀释，原液使用就可以。

需要用呼吸机么

不需要，直接腹腔注射。

阿佛丁使用剂量多少？

小鼠按 30μl/g 计算；大鼠按 25ml/kg 计算。小鼠20g，需要0.6mL.

这个1.25%三溴乙醇是多少mg/ml？

体积分数的1.25%，其他涉及工艺暂时未公开。

阿佛丁的作用时间

麻醉起效时间＜5min，维持时间在30~50min范围内，仅用于啮齿类动物（小/大鼠）麻醉。

阿佛丁麻醉过程，可以中途追加计量吗？

麻醉能维持时间长：30~50min,中途可以少量追加剂量。建议提前按照20~30μl/g从低剂量开始进行预实验，确定最终麻醉剂量。

给药体积这么高吗，不会积液吗

小鼠按30μl/g计算给药量，体重20g左右，约给药600ul，咱家动物实验测试及客户使用也较多的，不会积液。

阿佛丁，麻了之后老鼠是肌肉松弛，但是还有痛觉的吗？还是没有痛觉的？

会暂时失去痛觉或者痛觉延迟。

给鱼麻醉可以的吗

不可以，用于啮齿类动物的。

是无菌的吗，怎么保存

这款试剂是无菌的，适量无菌分装后建议2~8℃避光保存1年或者短期存放于室温不超过三个月。

会不会有肝毒性、肾毒性？

说明书的剂量是进行过验证的，在推荐的剂量范围内都属于安全剂量，短期使用不会有毒性。

如果要维持2-3小时，是给过量麻药还是中途补加呀？

建议中途少量补加

可以用于兔的麻醉吗？

不可以，推荐用乌拉坦（MB2793) 或者是水合氯醛(MA1300)。

可以用于植物吗？

也可以的，如果之前用过其他品牌的同款产品，按照之前的实验流程操作就可以。如果第一次用的话，建议是参考文献中步骤进行操作，https://doi.org/10.1038/s41467-024-50782-3，可以参考一下这个文献，这个是客户使用我司产品发表的文献，做的植物叶片方向的。

想要一个染料做活体成像的

MB1834或MB1837均可。使用钾盐的客户更多一些。可以先在裸鼠体内注射luc-标记的细胞，然后注射荧光素底物，进行活性成像。

做体外实验，用荧光显微镜看没有光呢。

这款是化学发光，化学发光光子产率一般低于激发的荧光，所以普通显微镜很难看到，肉眼也看不到；可以选择多功能酶标仪，利用化学发光模式全波长扫描，如果想设置Ex：328，Em：533，或者用小动物成像仪进行检测（是热成像，颜色并不是荧光颜色）；
看转染效率分荧光和化学发光，这款是底物，是与酶和ATP催化反应发光，而荧光是通过激发，比如，如果想用荧光检测转染效率，可以将sirna标记上荧光，如FITC，cy5等，或者质粒标记GFP等，利用lipo2000脂质体制备复合物，转染进行细胞中，然后转染成功的细胞内会有绿色或红色荧光，通过定性和定量看转染效率；是两种不同的方法。

做体外的时候放在什么环境中预热

37℃或者常温都可以。

做活体成像需要除菌吗？

建议药物工作液配置后过滤0.22um滤膜除菌再用，防止细菌的影响。

这个做动物活体成像可以用纯水溶解么，我看网站上写着是要用D-PBS。

mb1834动物实验建议用D-PBS，说明书给的是最适条件，如果暂时没有的话，也有客户用PBS也行。无菌水适合细胞体外实验配置母液；PBS或DPBS，常用来进行生物学研究或者细胞相关研究。PBS/DPBS为等渗溶液，PH为7.2-7.6之间。DPBS和PBS之间无差别，只是通常情况下，DPBS是不含钙镁离子。钙镁离子可能会抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg²⁺是催化荧光氧化的重要因素，Ca²⁺是和腔肠素氧化有关的离子。其他的盐溶液也可用来溶解荧光素，但要避免溶液中的阳离对实验造成影响。

D-荧光素钾盐能不能用于检测转染luciferase的细胞？用裂解么？用ripa

不需要裂解，D荧光素钾盐有很强的的穿透性，可以穿透细胞膜，所以可以不裂解的，如果想裂解的话也可以，裂解反映的更好，荧光更强 ，裂解的话不能用ripa。需要用温和的裂解液，推荐我司MA0523。
具体方法参考说明书。https://meilunhelper.com/uploads/guide/MB1834.pdf

D-荧光素钾盐配成液体放4度变黑了。

氧化了，这个建议现配现用，如果实在想储存，用无菌水制备100X荧光素原液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。分装量尽量在1-2次，也避免反复冻融。

D-荧光素钾用pbs配好了，能放多久？

D-荧光素钾用pbs配好母液，分装避免反复冻融。-20度建议 1-3个月内用完，工作液建议现用现配。

D-荧光素钾盐做活体成像实验1只鼠大概给多少？

小鼠体积一般是20-25g，一只小鼠给药量是3-3.25mg。如果是大鼠的话按照200G体重的话一只需要30mg。这个实验都是做裸鼠比较多的。

D-荧光素钾盐可以透过血脑屏障吗？

荧光素钾盐穿透能力比较强，可以透过血脑屏障。也有我司客户这方向的发表文献支持。

D-荧光素钾盐和D-荧光素钠盐的区别是什么？

目前有三种产品形式：D-荧光素（游离酸），D-荧光素盐（钠盐和钾盐）。主要差别在于溶解特性：前者的水溶性以及缓冲体系的溶解性都较弱，除非溶于弱碱如低浓度NaOH和KOH溶液。可溶于甲醇和DMSO；后者能够易溶于水或缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。
荧光素钾盐和荧光素钠盐应用上类似，两者的差别在于物理性状上如外形和溶解性。钠盐的水溶性高于钾盐。从目前发表的文献来看，钾盐的使用率远高于钠盐，尤其是体内实验。所以做活体成像等首推荧光素钾盐形式

给药方式和剂量？

注射量取决于注射方式，具体见官网说明书描述介绍。https://www.meilunbio.com/product/mb1834/
注射入体内10-20 min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。

D-荧光素钾盐的检测波长？推荐仪器？多功能酶标仪能用吗？

化学发光检测，无需激发波长。如必须设置波长，可选择萤火虫荧光素检测波长是 560nm
推荐仪器：1、具有生物化学发光检测模块。荧光素产生的光可以被光度计或闪烁计数器检测。常见的活体成像仪器：如 IVIS® Lumina 小动物活体成像系统，德国 Bruker 公司的 In-Vivo Xtreme 多模式小动物活体成像仪。2、多功能酶标仪：需要和仪器厂家确认是否具体生物化学发光检测模块，不能用荧光和吸光检测。

用小鼠不剃毛检测可以吗？

建议使用裸鼠，因为带毛的小鼠可能有自发荧光，会干扰检测，或者可以试试把小鼠的毛剃掉后再进行检测。

D-荧光素钾盐活体成像荧光强度不同实验差异较大？

注射方式，动物类型以及体重等都会影响信号的发射，因此建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定最佳信号平台期和最佳的检测时间。

D-荧光素钾盐是否对所有细胞都有效？

荧光素钾盐对大多数细胞类型有效，但不同细胞类型对荧光素钾盐的摄取和保留能力可能有所不同，需进行预实验确定最佳标记条件。

D-荧光素钾盐在活体成像中的半衰期是多久？

荧光素钾盐的半衰期因动物种类、注射方式和剂量而异，通常为几十分钟或数小时。

D-荧光素钾盐成像是否会影响动物的生理功能？

在适当的剂量下，荧光素钾盐通常不会对动物的生理功能产生显著影响。但仍需监测动物的生理状态，确保实验安全。

怎么将荧光素注入小鼠体内，注射方法之间的区别是什么？

荧光素可通过腹腔注射或尾部静脉注射注入小鼠体内。约1 min可扩散到小鼠全身。大部分情况下使用荧光素浓度为150 mg/kg。对于20 g的小鼠约使用3 mg的荧光素即可。对于腹腔注射来讲，扩散较慢，开始发光较慢，持续发光时间较长。对于荧光素的尾部静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间较短。

荧光素钾（钠）盐溶液如何配制？必须用不含钙离子和镁离子的 DPBS 溶解吗？

1、下面建议浓度来源于文献：
1）储备液（体外实验用） 浓度100mM，约相当于30mg/mL。用无菌蒸馏水溶解。 建议：现配现用，若无条件，可分装保存。 长期保存可能会导致信号衰减。
2）1×工作液（体外实验用） 浓度0.5mM，约相当于150ug/mL。用预热的培养基稀释储存液至 1×。建议：现配现用，若多余，则舍弃。不建议再次使用。
3）15mg/mL 储存液（动物实验用）不含钙离子和镁离子的 DPBS 溶解（因为一方面，钙镁离子通常对胰酶活 性有影响；另外一方面在活体成像实验时，Mg²⁺是催化荧光素底物氧化的 重要因素，而Ca²⁺是和腔肠素底物氧化有关的离子），混匀。0.22μM 滤器 过滤除菌。 建议：现配现用，长期保存可能会导致信号衰减。
2、 除了DPBS外，还可以用其他缓冲液溶解荧光素底物，如生理盐水Nacl、PBS等。原则上避免溶液中的阳离子对实验造成影响。可参考相关文献操作。

为什么双荧光素酶报告基因实验需要裂解细胞，但是用D-荧光素钾盐成像和钠盐进行细胞实验不需要裂解细胞？

1、荧光素酶是表达在细胞内，是一种不存在于人类物种的水解酶（所以本底很低），它不能透膜。荧光素酶的底物是环状小分子，是疏水的，因而可以透膜的，因此只要存在荧光素酶表达，那必然是外源的，那么将底物加到细胞培养基中或打到体内均能得到信号。
2、报告基因体外检测需要细胞裂解是为了避免细胞转染异质性、底物渗透不均匀和信号不均一而强行匀质化的做法。体外报告基因检测是一个定量且灵敏度很高的实验，报告基因检测需要ATP和氧气的存在，裂解细胞是需要把表达的荧光素酶完全释放出来，能够有更好的反应，因为细胞内的氧气含量有限，如果不裂解，会导致信号一定程度的降低（有的裂解液也做了一些优化，比如额外加了ATP以提高信号等）。因此报告基因体外检测裂解细胞能够有更好的信号；
3、活体成像，检测仪器功率大，能够透过皮肤，细胞，有更强的穿透力，因此可以不用裂解细胞就可以检测到很强的荧光信号，另外活体成像检测相对比较粗糙。

D-荧光素钾盐成像检测不到荧光

细胞方面：1）看下注射的荧光素酶标记细胞情况，需要荧光素酶和底物相结合才发光；
2)可以试试细胞裂解后在加荧光素钾盐进行测试，看下是不是细胞里荧光素酶太弱了影响而测不到
3）可以提升下质粒浓度
4）工作液建议现配现用，不然会失效，母液分装避光保存；
动物方面：1）注射后拍摄时间，可以优先做个预实验，找到最大发光时间点在进行拍摄；
2) 最好选用裸鼠，如不是，正常小鼠，避免毛发等干扰
3）注意注射剂量以及麻醉剂量等
4）成功进行活体成像实验需要以下条件：目的组织或细胞表达荧光素酶基因；荧光素底物注射成功； 依赖于发光部位的组织厚度。若实验不成功，可从上述因素查找，荧光素酶基因是否表达，荧光素底物是否未正确注射，及发光部位较深等

做体外实验，用荧光显微镜看没有光呢？

这款是化学发光，化学发光光子产率一般低于激发的荧光，所以普通显微镜很难看到；可以选择多功能酶标仪，利用化学发光模式全波长扫描，或者用小动物成像仪进行检测

无菌的吗

非无菌的，用于细胞或动物实验需过膜除菌（0.22um）

脂多糖可以用于诱导动物损伤模型吗

可以，诱导疾病研究的动物模型如炎症反应，急性肺损伤。

脂多糖作用RAW264.7细胞，没刺激起来

细胞的状态很重要，不能让细胞长得太密，状态太差或者分化太多，测定的NO都没有趋势；刺激时间和LPS浓度很关键，可以做下在不同时间点和不同LPS浓度下找到差异最大的条件。LPS刺激实验的稳定性要求排除过多的影响因素，血清成份复杂，建议用无血清培养基

脂多糖怎么溶解保存

溶解性：water 5mg/ml，本储存液（5mg/ml）可放在-20度保存，约1-3个月稳定；也可分装成单次用量后放到-80℃，3-6个月。避免反复冻融。
LPS溶液应储存于硅烷化容器内，因为LPS可吸附于塑料或某些玻璃器皿，尤其当其浓度＜0.1mg/ml时。但当LPS浓度大于1mg/ml时，上述吸附则可忽略不计。2）如使用玻璃器皿，则需旋涡振荡LPS溶液至少30min，以重溶被吸附溶质。

怎么溶解，动物给药

可以用无菌水或者生理盐水溶解，配成1-5mg/ml母液，建议分装保存，避免反复冻融，置于-20度或者-80度保存。动物给药可以将母液用生理盐水稀释至工作浓度，给药前需要过膜除菌再用。

脂多糖选择来源有要求吗？

LPS是一种O抗原，存在于细胞壁脂多糖(LPS)层,具有属、种特异性。其特异性取决于LPS分子末端重复结构多糖链的糖残基种类的排列。E.coli的不同菌株型号是根据菌株LPS的不同抗原特异性来进行区分。咱家这款是来自大肠杆菌O55:B5的脂多糖，可用于：
1.刺激肝细胞和非实质细胞• 刺激脾脏并研究Malitaf基因在鱼钝头鲷中的表达。
2.作为伴刀豆球蛋白A（ConA）和D-半乳糖胺/脂多糖（D-GalN/LPS）暴发性肝炎模型的一部分用于研究天然化合物橙皮素的作用等。
o55:b5和026：B6分别是大肠杆菌的两种血清型，血清型相当于LPS的毒力。不同血清型的LPS糖链的结构不同，对细胞作用也会有差别。具体要选择何种血清型的LPS需要您根据您要培养的细胞系或小鼠品系，要做的实验类型，参考一下相关文献用常用的脂多糖类型。

LPS可以用于人的细胞么

可以的

LPS来源

来自大肠杆菌，通过苯酚提取纯化

LPS的保存要硅烷化容器是什么容器

器具表面存在硅醇基团，可以对蛋白质等样品产生吸附，造成损失，需要用硅烷化进行封闭处理，通过硅烷化试剂二甲基三氯硅烷或六甲基二硅氨与载体表面进行反应，除去该基团的氢键结合能力；如果没有这种器皿用EP管也可以，配置LPS浓度大于1mg/ml，用之前在混悬仪上混一会再用

脂多糖作用于细胞，用CCK8检测没有抑制效果呢

1、母液建议配置后-20度保存，避免反复冻融，避免因稳定性不好，药效降低；
2、工作液现配现用；
3、在文献基础上，给药量可以适当调整，或者做个浓度梯度，不同给药时间的看下情况；或者自己用CCK8做个药物的IC50值；
4、细胞实验前要保证细胞良好的状态，药物作用有效浓度对不同细胞种类、细胞状态等也有不同的；
5、另注意下CCK8孵育的时间，避免过长或者过短而影响实验结果，检测时与镜下看下细胞状态

买的LPS，作用与小鼠早产，结果没有作用，还是按照正常日期出生的，没有促进早产作用

客户母液配置浓度比较低，而且置于4度保存的，可能稳定性受到了影响，建议母液浓度配置高一些，母液长期保存置于-20度，-80度。避免反复冻融。
工作液要现用现配。
可以按照文献剂量，提高一下浓度和作用时间等（10-100倍）看一下效果，这款是促炎症反应的，也有文献用于促小鼠早产方面的研究。
脂多糖(LPS)诱导的小鼠早产模型胎盘炎症反应，方法： 孕17 d小鼠分组为腹腔注射PBS组(Control组),腹腔注射LPS(LPS组),.构建LPS腹腔注射诱导的17 d孕小鼠早产模型.在第2剂LPS注射后1、6、12 h及出生时留取胎盘组织,检测Treg细胞标志物叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)、白血病抑制因子(LIF)、血红素加氧酶-1(HO-1)和白介素6(IL-6) mRNA及蛋白表达水平.结果组胎盘组织中Foxp3、HO-1、LIF在第二剂LPS注射后1、6、12 h及出生时表达显著下降,IL-6表达显著增高

MB5198 的分子量是多少

这款分子量大约50-100KDa，只是一个范围，这个是多聚体，没有具体的结构式和分子量的，而且测试这个意义不大

lps诱导bv2细胞极化有推荐的浓度跟时间不？

这个建议客户看一下相关文献，参考文献浓度，然后最好做一个浓度梯度，摸一下最佳浓度。我司做过BV2细胞的诱导，使用浓度是4µg/mL，孵育24h，使用细胞是5代以内的。另外注意事项如下：
1、母液建议配置后-20度保存，4度保存尽量一周内用完，避免因稳定性不好，药效降低；2、工作液现配现用；3、在文献基础上，给药量可以适当调整，或者做个浓度梯度，不同给药时间的看下情况；或者自己用CCK8做个药物的IC50值；4、细胞实验前要保证细胞良好的状态，药物作用有效浓度对不同细胞种类、细胞状态等也有不同的；5、刺激时间和LPS浓度很关键，可以做下在不同时间点和不同LPS浓度下找到差异最大的条件。

脂多糖可以做动物鱼的炎症造模吗

可以的，可以根据您之前使用脂多糖的血清型类型进行选择，如果之前使用的是大肠杆菌 055:B5，可以看下我司MB5198这款

生理盐水和PBS可以溶吗

这款是水溶性的，PBS和生理盐水也是可溶的

脂多糖可以诱导巨噬细胞变成M1吗

可以，需要搭配 LPSMB5198+INF- γMB5954

LPS可以有效的刺激小鼠建立败血症模型吗？

可以的

LPS但是一旦拆封有效期？也还是4度保存吗 想买大包装的建议分装放 4 度么？

粉末2-8℃保存，避光防潮密闭干燥，自生产之日起6年有效。粉末开封后分装的过程和保存的时候 一定要避免吸潮，也是按照说明书条件保存

脂多糖诱导 不会引起腹泻吗？为什么官网动物实验数据是眼睛的问题

如果是造炎症模型，炎症反应有一项是LPS通过激活Toll样受体4（TLR4）通路，引发大量促炎因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）释放可能引起结膜充血和分泌物增多；LPS给药途径以及造模原理大部分是炎症反应，大部分小鼠小鼠品系（如C57BL/6）对LPS诱导的肠道损伤耐受性较强，所以可能有的时候会有轻度肠屏障损伤，但是腹泻的比较少，看做什么，炎症一般是1-15mg/ml；脓毒症或者肺损伤一般是10-30mg/ml；炎症给的低一般不会腹泻，高剂量就会有，不同鼠表现不一样

炎症模型炎症 是在哪一种小鼠模型上，浓度是多少？观察了多长时间呀？

LPS体内模型建立
实验动物：C57，雌雄各半
给药方式：腹腔注射
给药剂量：3mg/kg
药物配制：生理盐水将MB5198溶解成1mg/ml的溶液即可
实验分组：空白组-生理盐水
MB5198组-1mg/ml溶液，给药2天做行为分析，结果官网上有可以去看一下

适用于人源的巨噬细胞THP-1不？

可以的，这个不分种属。我司客户发表LPS构建THP-1炎症模型可以发客户参考。http://115.239.174.206:8081/vpn/1/https/NNYHGLUDN3WXTLUPMW4A/kcms2/article/abstract?v=GQPEaosfmU8560F5qbsVvNrDHUWqG0AdRSmSwkNTI0_Cm_drD9Gb9TXDXJpbw33ujwqXN0dG8CJHNTUsJw6NhLwWcY_s7VOthg7qD-jhnpB7LYuHkJhwMB2oKbl1bZMnMpxK3XMuPcL1t07pRIm6-0c0SXMJ-n0bXCHFgKBp12w-ev5SmhsHx6MgMLnzPb66&uniplatform=NZKPT&language=CHS

脂多糖 COA里面有一个效价≥500000eu/mg，含义

国际标准品（如 WHO 内毒素标准品）的效价被定义为特定单位（如 1ng 某标准品对应 1000U），待测脂多糖的效价通过与标准品在相同实验体系中引发的反应（如鲎试剂凝胶反应、细胞因子释放等）进行比较而确定。

lps可以灌胃给药么，或者咱们这个是推荐怎么给药方式啊

看文献用其做坏死性小肠结肠炎（NEC）可以灌胃给药，咱家一般做炎症造模常用腹腔给药，如官网数据展示

我在你们公司买的这个LPS怎么打开

盖子上有箭头，沿着箭头方向打开，里面是有胶塞的，称量的时候把胶塞拔开，然后称量之后如果没用完，连同胶塞用封口膜封上

LPS配成10mg/ml的，它不溶

建议配置5mg/ml浓度，37度超声助溶下再用,这个产品本质检标准就是Slightly Hazy，实验室一般是充分混匀后，实验前用生理盐水稀释至工作浓度，过滤0.22um滤膜除菌就可以用于动物注射了

脂多糖动物给药，气管给药，上午一共做了三只，一只给到2/3的已经死了，还有一只给完的时候就直接从鼻子里呛出来了

有可能气管给药，比如给药过程不小心插管过深误入单侧支气管，或刺破气管 / 肺组织，可能会短时间内导致呼吸衰竭死亡，或者不小心药物反流了刺激影响，因为客户是给药还没注射完动物就死了，可能是这方面影响，如果是药物毒性，一般需要动物吸收药物作用一段时间。气管给药可以，看文献制备痰湿阻肺模型有这种给药方式的，注意下给药的操作过程，避免不小心机械损伤脏器或者反流影响，另看下客户是否有给麻醉处理，如果有麻醉处理，也需要在注意下麻醉剂用量大导致的毒性。另对小型动物（如 20g 小鼠），气管容积极小，若给药体积过大或推注过快，药物会瞬间充满气道，阻断气体交换，导致窒息影响，如果客户实验需求的给药量很大，为了减小给药体积，也可以适当提高药物配置浓度

脂多糖有测核酸含量吗，我看COA里没有这一项

质检每一批都测核酸含量，因为这个不是质检标准项目，所以没体现在质检单里，是<300 ng/mg的

这种是可以用来脓毒症小鼠造模吗

可以的

脂多糖小鼠造模给药剂量

炎症造模一般是1-15mg/ml；脓毒症或者肺损伤一般是10-30mg/ml

需要过滤处理吗？

血清在生产时已经过三次0.1µm无菌过滤，客户收货后不需要过滤；后续客户实验有特殊需求，比如灭活处理等，可能纤维蛋白原析出较多，如想去除，也可以离心或者过滤去除（不好过滤易堵）。

血清浑浊

胎牛血清是天然提取物，其中含有多种蛋白等营养物质，且血清是在低温条件下收集并迅速加工处理，导致一些纤维蛋白原仍存在于溶液中。虽然在生产过程中会通过过滤去除绝大部分的纤维蛋白，但解冻过程中，血清中的脂蛋白变性、纤维蛋白会再次转化成纤维蛋白析出，形成沉淀。这些絮状物不会影响血清本身的质量。解冻后的沉淀物可能是如下情况：
① 纤维蛋白：在解冻过程中，血清中的纤维蛋白原会再次转化成纤维蛋白析出，形成较大的沉淀物，有时肉眼可见。
② 磷酸钙：一种常见的沉淀物，表现为云状。在倒置显微镜下可以观察到呈布朗运动的小黑点，因此常被误认为是微生物污染。
③ 胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质：它们也是血清中出现沉淀物的常见原因。
血清解冻注意事项：
1.逐步解冻法解冻（-20℃–4℃–室温）；如解冻时跨越的温度较大，例如：直接从-20到37℃，比较容易产生沉淀；
2.解冻过程中请不时轻柔颠倒摇匀（避免产生气泡），使血清成分和温度混合均匀；
3.血清解冻后请进行分装成小体积，每次解冻后的小体积血清请尽快用完，避免反复冻融；
4.血清热灭活非常容易产生沉淀，美仑血清一般情况下无需热灭活，如实验需要必须执行热灭活，请遵守56℃，30min原则，并且随时摇晃均匀。
沉淀或者絮状物解决办法：
可用离心3000rpm, 5 -10分钟之后吸取上清，不影响质量及细胞培养状态。

血清颜色很红

根据血红蛋白含量的不同，胎牛血清可表现出黄色或红色，我国的细胞培养用血清标准是不高于20mg/dl，这个指标的意义在于能体现出采血过程的严谨规范程度，良好的操作能降低血清的溶血。优质胎牛血清或多或少总有点溶血，因为真正的胎牛血清凝血功能差，红细胞容易破裂。优质的血清呈现出谈黄、微红色或橘红色，不过每一批确实会表现不太一样，我们每一批质检都会检测总蛋白，血红蛋白，免疫球蛋白等重要指标，而且每一批都做细胞生长方面测试，使用上都是没有问题的。

养细胞有黑点

黑点有可能是外源污染，细胞碎片或者分泌物，或是血清沉淀。空培的血清出现浑浊，在显微镜下观察到小黑点且在37℃时候会增加，应该是血清的磷酸钙沉淀物，在 37℃ 下培养血清、反复冻融血清、长期储存在 2-8℃、在室温下放置时间过长的情况下都可能会使沉淀增多，属于正常情况。

有黑胶虫

是血清中的磷酸钙析出，一种常见的沉淀物，在倒置显微镜下可以观察到呈布朗运动的小黑点，因此常被误认为是微生物污染，根据经验和大量验证数据表明，血清沉淀并不会影响细胞的正常生长。

血清怎么梯度替换？

更换血清需要梯度替换，梯度替换原则：80%(原来)+20%（新）——50%（原来）+50%（新）——20%（原来）+80%（新）——100%（新），梯度替换期间最好每传代一次进行一个梯度替换，可以先稳定下，让细胞慢慢适应下，避免突然更换血清品牌细胞不适应而引起影响。

用此血清培养时，RAW细胞分化了

这个细胞本身就容易分化 跟血清没有太大关系 培养的时候可以注意一下以下几点：1. RAW264.7巨噬细胞三天不传代容易分化，很难吹下，每一次接种密度都要控制好；2. 分化的细胞贴壁牢固，传代的时候千万不要强制性吹下这些细胞，只接种容易吹下的那些未分化细胞；3. 吹打的力度一定要轻，切勿暴力吹打；4. 培养时，无法保证100% 不分化，通过传代可以将分化比例控制在一定范围 5. RAW264.7细胞分裂活跃，最好每天都观察看看.

用此血清培养时，细胞老化了

一般细胞老化可能原因有：
1、在体外传代次数太多或太久
2、培养液营养不够（换培养液应该根据自己细胞消耗培养基的情况来确定是否该换，不要等培养液过于黄了再换液；而且细胞对血清比较敏感，直接影响细胞的生长）
3、接种密度不当
4.、传代（消化对细胞的表面蛋白质有一定破坏作用，因此不能长时间进行消化并且在选择消化酶时也要选择较为合适浓度）
5、完全培养基过酸或者过碱。建议完全培养基少量配置，一周内使用，如发现类似情况可以拧松瓶口至于二氧化碳培养箱中放置恢复调节下ph。

血清4度能放多久

里面蛋白是持续降解的，建议4度不超过4周。

血清放-80冰箱可以放多久？

不建议放-80储存，血清需要4度解冻，温差跨度太大，容易出絮状物。

血清有灭活过吗？需要灭活吗？

没有灭活过。一般普通细胞培养等是可以不用灭活处理的，可以直接使用。如进行免疫学研究相关方向可能需要热灭活处理，如实验需要必须热灭活，应严格遵守56℃，30min的原则，并随时摇晃均匀。血清热灭活非常容易产生沉淀，之后可以离心处理取上清分装保存。

冷冻血清37度水浴解冻可以吗？

解冻时跨越的温度较大，直接从-20到37℃，非常容易产生沉淀 比如纤维蛋白析出，不太建议客户这样解冻。可以先在 2～8℃冰箱放置12～24小时左右使之部分溶解，然后在室温下使之全溶。

血清包装慢病毒效果好吗？

我司实验室之前做相关实验的时候一直使用这款血清，研发的老师用着是没问题的。

照紫外了还能用吗？

血清不建议照紫外，会影响其中蛋白等营养成分，如后续继续使用建议混匀后先小试培养对比看下效果。血清本身有纤维蛋白析出，如果是这个絮状物是正常，但长时间照紫外后可能影响蛋白变性等引起一些异常，如有其他异常等，这种的最好谨慎使用，避免影响细胞。

xxx细胞推荐哪个血清？

pwl001 是优级胎牛血清，可用于普通常规肿瘤细胞系培养等。pwl217是特级血清血清，效果比pwl001更好，能够满足几乎所有细胞的生长营养需求，包括各种肿瘤和转化细胞系、原代细胞、免疫细胞、部分干细胞（胚胎干细胞、间充质干细胞等）等。同时由于本血清中血红蛋白和内毒素含量水平都非常低，因此特别适合于培养对环境相对敏感和要求较高的细胞。pwl002为澳洲胎牛血清，原代细胞、干细胞、T细胞等对不好培养的细胞建议使用此款血清。如果您之前用gibco澳洲血清的话用PWL002比较好。

血清的有效期是多久？

自生产之日起5年有效，针对每个批次，请通过质检文件确定具体效期日期。

血清应如何保存？

血清在生产制备完成后，通过质量检测，然后被运送至市场上销售。整个过程中，包括运输流程，储存温度应严格保证在-20℃，避免反复冻融影响血清活性。实验人员在收到血清，检查完好后，及时将血清送至-20℃冰箱中储存，用时再取出解冻。如果一次无法用完一瓶，应该无菌分装后冷冻保存。注意避免反复冻融。

血清igG用什么方法检测的？

elisa检测方法。

某款产品使用美仑哪一款替代？

可以根据某品牌产品的培养基成分，核对一下我司产品的具体配方是否一致（具体配方详见说明书），如果配方一致完全一致可以进行替代。但需要注意，某些细胞比较敏感，如果更换培养体系，建议梯度替换，以保证细胞的良好状态。

某个细胞用哪款培养基，或某个细胞用这款培养基可以吗？

（1）如果是您经常培养的细胞类型，可以根据您一直使用的培养基成分，对应配方查找我司相关产品。（2）如果您是首次培养这款细胞，可以根据细胞株供应商的推荐体系对应选择使用合适的培养基。（3）可参考我司官网《细胞培养产品选择指南》选择合适的培养体系。

培养基里某些组分含量，比如这个里面含多少碳酸氢钠？

产品说明书中附有具体成分表，里面对应了不同成分的具体含量，可供参考。

培养基的缓冲体系是什么？

（1）碳酸氢钠，pH 6.8-7.8为细胞生长的最佳pH条件，多数培养基利用碳酸氢钠进行缓冲。碳酸氢钠的缓冲需要二氧化碳。高碳酸氢钠 (1.5-3.7g/L) 需要5-10%二氧化碳；低碳酸氢钠 (0.35g/L) 不需要二氧化碳培养箱。（2）HEPES，是一种氢离子缓冲剂，其作用不依赖于二氧化碳，在一定范围内对细胞无毒性作用，能较长时间控制恒定的pH范围，保证细胞良好生长，部分细胞对酸碱度的变化非常敏感，建议使用含有HEPES的培养基。

观察培养基有析出还能用吗？

先确定培养基是否被冰冻过，如果有，可能会造成磷酸盐或氨基酸的析出，尝试将其加热至37°C后通过摇动将沉淀溶解。如果仍有沉淀，请弃用此培养基。

开封后的培养基在冰箱放置会变紫？

培养基保存在4℃冰箱时，培养基内的CO2会逸出，造成培养基越来越偏碱，用此培养基培养细胞会引起细胞生长停滞或死亡。此时可向培养基中通入过滤的CO2调整pH。

可否使用与原先培养条件不同的培养基？

不建议。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。如因实验条件影响需要更换体系，需要梯度替换，以保证细胞的良好状态。

细胞生长十分缓慢。这可能是由什么原因所导致的？

可能的原因及应对方法如下：（1）未使用合适的生长培养基：请依照供应商推荐的培养基，预热后进行培养。（2）生长培养基中的血清品质不佳：使用另一批次的血清。（3）细胞传代次数过多：请使用低传代次数的健康细胞。（4）细胞铺满后的过度生长：请在长满前的对数生长期对哺乳动物细胞进行传代。（5）培养物受支原体污染：丢弃细胞、相关培养基和试剂。获取一批新细胞，并使用新鲜培养基和试剂进行培养。如果您的细胞很珍贵，可使用MA0340Meilunbio支原体清除试剂(1000X)。（6）由于细胞的特殊种类，培养基中缺少某些生长因子；可以向培养基中添加适量细胞生长因子，保证细胞的培养条件。Meilunbio®可为您提供多种细胞因子产品，如果您想快速查找并确定满足实验需求的细胞因子，建议参考官网《细胞因子产品选择指南》。

培养基是怎么灭菌的

0.22um+0.1um滤膜过滤处理

培养基ph多少

培养基的ph7.0-7.4这个标准，不同批次会略微不一样，具体可详见COA

培养基可以高温高压么

不建议，如果添加其他药物的话，要么加之前过滤，或者加进去之后过滤，推荐用0.22um过滤除菌

胰酶消化完不是圆形，漂浮的菱形。

说明部分细胞不是被胰酶消化下来的，是被吹下来的。
消化时间不够、环境温度偏低影响胰酶消化、加入胰酶后混合不均匀、胰酶PH值偏酸、胰酶保存不好作用下降、消化前未冲洗细胞、细胞长了多层堆叠、胰酶配制不能接触金属用胰蛋白酶消化贴壁细胞，使细胞会变圆，是由于壁细胞在经过胰蛋白酶浸泡之后，细胞会失去保护层，细胞的生长能力减弱，在这时，在细胞内部骨架的张力作用下，细胞会变成球形；而且用胰蛋白酶消化贴壁细胞时，不仅可以消化细胞膜上和培养皿结合之间的蛋白质，长时间以往也会消化细胞中所含有的膜蛋白，从而对细胞具有一定的损伤作用。

消化细胞需要很长时间。

胰酶消化时长问题可以注意的几点：1.胰酶消化的温度和时间比较重要，同时也要结合细胞的生长状态和情况。胰酶从4度冰箱拿出后，在37度先孵育5分钟，以促进其活性最大发挥。消化时可以37度孵育，观察。
2.胰酶消化前，用PBS清洗一次，再添加胰酶，避免残留培养基影响胰酶效果。
3.一般镜下观察大部分视野细胞近圆形,少量细胞漂浮;细胞较均匀的消化为单个细胞说明消化效果较好。MA0233对于难消化的细胞您可以这样试试：25cm瓶的话：加胰酶前用PBS清洗一下，弃去干净，然后加胰酶1ml，晃一晃，大概10s-20s，然后吸出500ul，留500ul，37度消化3min左右（置于37度培养箱消化，时间可以根据细胞情况适当延长），拿出细胞之后轻轻拍下瓶壁，能看到细胞流下来就可以正常加培养基了，加胰酶的3倍，可以这样试试。

用胰酶传代后细胞飘

这个情况应该是消化过了，可能原因如下：1、胰酶消化时间稍微有些长了，细胞变圆，间隙变大，尚未脱离培养基即可终止消化；2、加入完培终止消化的体积有些少，可以再多加一些完培，最好是三倍体积的完培，可以彻底终止消化反应。3、每批次消化力度可能会有差异，因此刚换一个新批次，在消化的时候可以中间取出来观察下细胞形态，细胞基本变圆就可以终止消化了。

胰酶保存温度是多少？可以放4℃吗，另外这个需不需要避免反复冻融

胰酶正常是-20储存的；可以短期放4度，1个月内，但是不建议长期储存放4度；尽量避免反复冻融。

胰酶可以直接37度水浴融化吗

不建议，在高温度条件放置时间太长会影响酶活，整瓶解冻建议4度或者室温融化，融化完全后混匀进行分装冻存

胰酶这个重组和不重组有什么区别

来源和制备方法不同，重组的避免异源性，效果更温和，如果客户做干细胞，ips等这种更适合。

酶里面的酚红的作用是什么？

胰酶有没有酚红有啥区别？

酚红的作用：pH 值指示剂，pH 值低时培养基呈黄色，pH 值高时培养基呈紫色，pH 值 7.2～7.4 时为红色，最适合细胞培养。
在一些无血清培养基的配方中酚红会干扰钠-钾平衡培养，干细胞或细胞克隆时倾向于不加酚红。
酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），在培养雌激素敏感的细胞（如乳腺组织）时，建议使用不含酚红的培养基。
酚红的颜色会对流式细胞分析产生一定的干扰，不建议使用含酚红的培养基制备细胞样品。

干细胞专用的消化酶吗？

PWL085 重组胰蛋白酶消化液（含EDTA，不含酚红），干细胞专用。

冻存液用了一段时间颜色变粉了

产品里面含维生素C，接触空气多了之后颜色会慢慢变深，而且里面含酚红等指示剂，每次开瓶等操作液体pH可能变化，影响了，客户那个应该开封一段时间了，如使用量少可以分装一些，分装可以选择小口的离心管保证接触空气面积小，同时注意每次开封之后尽量减少接触空气时间。

冻存的细胞80度可以放多久？液氮可以保存多久？

在-80℃冰箱一年理论上，-80℃过夜后，次日将细胞投入液氮中，可长期保存。

这款冻存液的DMSO含量是多少？

PWL234 和MA0405、PWL102的DMSO比例是8%，MA0401是8.7%，MA0205是10%。

无血清冻存液无蛋白和无酚红这两款有什么区别？

MA0401和MA0405两款配方不同，MA0405里含蛋白，无酚红，MA0401里不含蛋白成分，但有酚红，两者冻存细胞的使用方法类似都是非程序降温冻存液，效果也差不多(MA0405会稍好些），需要注意的是MA0405含蛋白，对于如果客户用其冻存的细胞后续是用于干细胞回输、蛋白纯化方面等方面不推荐，可能会对实验有影响。

原代细胞冻存用哪个冻存液？

最合适的肯定是PWL234，但价格比较贵。其次MA0405更合适，但是含蛋白了，如果客户培养条件不是那种无蛋白的就用MA0405就行。但是有些原代细胞需要用无蛋白条件养，这个情况的话就推荐MA0401。

细胞冻存液化了，大概四个小时左右没在-20℃还可以用吗？

冻存液咱们测过1周的稳定性，37℃一周的话存活率可能会下降10%左右，如果是25度基本小于5%的。而且冻存液其实就是4℃储存的。

细胞冻存液要避光保存吗？

尽量避光，不用特别严格避光，正常放冰箱就行。

细胞冻存密度.

细胞的冻存密度以1×10^6~1×10^7 cells/ml为宜。

官网MA0401，MA0405，MA0205有啥区别？

MA0205含有FBS，需要梯度冻存，耗时较长;ma0401不含有FBS，无外源血清干扰，不需要梯度降温，可以直接放-80℃，但是不能直接放液氮，含酚红 ma0405无酚红，含蛋白，但是是非哺乳动物来源，不需要梯度降温，可以直接放-80℃，但是不能直接放液氮。

原代细胞、干细胞、免疫细胞用哪种冻存液？

PWL234推荐用于各种常规哺乳动物细胞的冻存，尤其适合于无血清培养的干细胞、免疫细胞、蛋白表达细胞的冻存。PWL102是根据免疫细胞特征进行了特别优化，T细胞、NK细胞、CIK细胞等。

您这边有没有类器官冻存液呢？

理论上咱的PWL234可以，但是我们暂时没有验证，如果客户想试试，可以少量冻存试试，隔几天在复苏看看效果。

pbmc用哪款冻存液比较合适呢？

可以看一下PWL102，不过PBMC细胞本身复苏存活率相对低，建议珍贵细胞首次先冻存1-2支，复苏看下效果后，再大批量冻存使用

T细胞用的冻存液是哪个货号？

可以看下PWL102，或者PWL234。

浓度是多少？

1X的是0.01M，即0.01mol/L。10X为0.1M。

常温放置会有沉淀么？

常温一般不会。

PBS 里面含EDTA吗

不含EDTA。

ph是多少

7.2-7.4。

使用是注射用水配的么？

是的，多效蒸馏法。

渗透液是多少呢

pbs 渗透压 范围 280-315 mOsm/kg。

这款PBS是不含钙离子和镁离子的吧

是的，不含钙镁离子。

是无RNA酶的吗。

不是，看下这款 PBS(1X),无DNA/RNA酶细胞培养级总货号: MA0015-D。

微生物检测是测得什么?

微生物检测一般是按照药典方法，主要包括细菌，真菌检测等，具体操作方法可以参考中华人民共和国药典2010版二部附录ⅨJ 细则.

PBS的灭菌方式是那种？

过滤膜除菌.

用作鞘液推荐哪款PBS？

MA0015。

是无菌的吗?

是的。

PBS和DPBS什么区别？

D-PBS和PBS比：磷酸盐的含量稍低些，一般含有钙镁离子。D-PBS主要用于胚胎学方面的研究，多用于胚胎的冲洗液、冻存液和培养液。如果用于消化之前的洗涤的话必须用pbs，因为d-pbs的钙镁会和胰酶里的edta反应。如果是用于配置一些细胞培养添加剂的话一般用d-pbs

MA0015这款会使RNA降解。

这款是细胞培养过程使用的，如果需要无RNA酶的可以选择这款：MA0015-D PBS(1X),无DNA/RNA酶细胞培养级，这款更适合客户的需求。

运输冻成这样了。不影响产品质量吧？

不影响 常温解冻就行 有析出的话 就37度加热一下

MA0015这款会使RNA降解。

这款是细胞培养过程使用的，如果需要无RNA酶的可以选择这款：MA0015-D PBS(1X),无DNA/RNA酶细胞培养级，这款更适合客户的需求。

MA0015和MA0015-D的区别是什么？

MA0015-1是用于普通就是细胞培养的，无菌的，但不是无DNA和RNA酶的。Ma0015-D是无菌，无DNA和RNA酶的。

PWL050和MA0015有什么区别？

配方一样的，PWL050内毒素更低。

放4度结晶了，有沉淀，有析出

是盐成分析出了，室温或15-20℃水浴溶解，严重的话37℃温浴试一试，絮状物没有了，就可以正常使用

是中性的吗？

是的，PH：7.2-7.4。

免疫染色固定液，是不是咱们的组织固定液？

配方上不完全一样，但是功能上一样。免疫染色固定液主要成分也是4%多聚甲醛，还有点其他辅助成分，都是固定的，都能做免疫荧光，免疫组化等实验。

细胞固定：室温或4℃固定10-30min，用缓冲液漂洗后即可用于染色。这个缓冲液用什么？

可以用 PBS 或 HBSS 洗涤。

使用体积和组织的比例？

固定液一般按照组织体积的10-20倍，组织较大例如肝建议20倍加入。

含DEPC吗？

不含。

固定后的组织该如何保存呢，因为不能立即送样染色。

固定24小时之后如果有血水可以换液，之后一直室温存放，尽量不要超过1个月。

可以直接把组织放进去吗？

如果直接剖出来有一些组织可能很软，取出过程可能容易碎，可以灌注，然后再取出放置于固定液中固定。

可以长期常温泡组织吗？

如需长期储存在固定液中，在切片之前可用缓冲液或水冲洗，再进行后续实验，我们试过储存1个月左右，再进行切片HE染色影响不大。

这个是否是无菌的

无菌的，经过0.1um滤膜过滤除菌。

Bouin’s固定液与MA0192（组织固定液）的区别

相同点：
PW1226和MA0192均能有效地固定组织样本，保持其形态和结构，防止发生降解。
两者都适用于多种染色技术，便于后续的组织学观察和分析。
不同点：
固定剂类型：
PW1226是混合固定剂。
MA0192是单一组分固定剂。
pH值：
PW1226的pH偏酸性。
MA0192的pH接近中性。
固定机制：
PW1226通过交联蛋白质和酸介导的固定作用。
MA0192通过甲醛的交联作用固定蛋白质。
穿透力：
PW1226穿透力强，但可能会引起组织收缩。
MA0192穿透力较弱，但对组织的收缩性较小。
固定时间：
PW1226的固定时间为30~60分钟，不宜超过24小时。
MA0192的固定要求超过24小时。
适用组织类型：
PW1226适用于结缔组织、肌纤维的组织。
MA0192适用于广泛的组织类型。
对抗原检测的影响：
PW1226可能会影响某些抗原的检测。
MA0192常对抗原的保存较好，适用于IHC（免疫组化）。

适合保存眼球组织吗

有文献资料显示可以用4%多聚甲醛对眼角膜结构固定，但其固定眼球时由于渗透压较大，对组织收缩作用强，有可能造成眼球内外压力不同，使眼球变性，形成固定液性的视网膜脱落。

着急用水浴快速解冻行不行

最好室温融化，着急的话水浴25度溶解

可以用来固定细胞做流式吗

可以的

组织固定液可以用来固定菌嘛

文献上也有用的，建议先小试看下

能不能用于肌肉的固定呢？

可以的

能固定多久，时间长有影响么？

24小时（室温或4°C）是普遍推荐的安全时限，不建议超过 48小时。时间长形态学失真，化学损伤都会有，所以不建议过长。也有将组织固定半年的，但固定时间长可能有损伤，片子可以观察得到。

D-PBS含钙离子和镁离子和不含的有啥区别？

成分上含钙镁的只是多了钙镁离子，其他一样；用途上：如果用于消化之前的洗涤的话不能用含钙镁的，因为d-pbs的钙镁会和胰酶里的edta反应，除此之外用于冻存液，培养液，添加剂稀释液功能是一样的

有些絮状物/析出。

可能是运输或者储存不当影响了，这个是钙镁析出了，一般加热溶解不回去，不能再使用了。产品需要4度保存和运输。

配置缓冲液的去离子水 可不可以用PBS替代呢

不建议

几个象限表示什么

左上象限（FITC-/PI+）表示坏死细胞，右上象限（FITC+/PI+）表示晚期凋亡细胞+少部分坏死细胞，左下象限（FITC-/PI-）表示正常细胞，右下象限（FITC+/PI-）表示早期凋亡细胞。

Annexin V/PI试剂盒为什么用不含EDTA胰酶？

Annexin V 是 Ca 依赖性蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 离子从而影响 Annexin V，进而影响结果。

其中PI的浓度

涉及配方暂时不公开

现在加完染料可以放置几个小时测行么？

建议1小时内检测，因为荧光会衰减

Annexin V/PI试剂盒做单染用普通细胞还是凋亡细胞？单染一定要做吗？

单染一定要做，需要画十字门调补偿单染可以用正常细胞做，但是正常细胞凋亡有的比较少，画门可能不是很清晰；建议设置经凋亡诱导的正常细胞、PI 单染和 Annexin V-FITC 单染 3 个对照组，正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。结果可用 CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），FITC 为横坐标，PI 为纵坐标。

凋亡试剂盒Annexin V款受不受GFP等干扰？

美仑凋亡试剂盒有三款，Annexin V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒；AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(50T)；其中货号MA0220，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，FITC发绿色荧光，PI发红色荧光；货号 MA0428 AnnexinV-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒中，将PI更换为了 7-AAD，也发红色荧光，但其发射光谱较PI窄，且发射波长更长，对其他检测通道的干扰更小；货号MA0429 AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒，选择PE（MB5943藻红蛋白）与Annexin V 偶联，其中PE 的激发波长为495,545或565nm ，发射波长575nm，发出红色荧光，在多色荧光分析中，在待检测的细胞已经表达GFP等绿色荧光蛋白的情况下，推荐客户选购Annexin V PE/7-AAD试剂盒。

Annexin V-FITC/PI可以做贴壁细胞原位荧光检测吗？

可以做原位荧光检测，注意：一定要用试剂盒里的buffer；染料加量适当提高。另如果给药组如果对细胞凋亡明显，导致细胞飘的多，则换液时候就会被弃掉一部分，这样检测凋亡比例可能就少了，所以收集上清后再收集消化细胞一起进行会更准确些

单纯检测磷脂酰丝氨酸暴露的情况，不需要染核，可以用Annexin V/PI（MA0220）试剂盒吗？

可以用的，不染核的话，不用PI就行了。

不小心把MA0220放置-20度保存，一周了，还能正常用吗？

PI是没问题，Annexin V-FITC不可冷冻。如想继续使用建议预实验试试，看看还能不能正常染色，如果确定没问题，再进行正常实验，以免浪费样本等

说明书中有两个单染，是必须做的么？

是的，建议都做

结果不太好，有啥注意事项么？

1.操作注意染色时Binding Buffer需要现用现配，用去离子水稀释，其缓冲液中有可促进染料染色效果2.细胞总数建议在 1×10^5 cell，如果每组细胞数量比较多也会影响染色效果，3.消化时间过长或离心速度过高导致机械损伤，细胞膜破裂，这样阳性PI 会高，4.未彻底去除死细胞或碎片，解决办法阈值设置高一些 可以到10^6；5.染色时间温度要控制妥当，如果有哪个染得不好，可以先加FITC染5min之后在加PI染15min；6.细胞本身：状态和密度都有影响，解决方案：密度一定要摸索好，状态要好，染支原体啥的会影响效果,7.做两个单染吧，用凋亡最明显的那组做两个单染，然后在分群看一下吧；8.上机设置在1万细胞数

之前我们买的凋亡试剂盒里面也有PI，可以用来测周期嘛？

这两个试剂盒里的PI浓度不一样的，各自里面的浓度都是针对其检测方向优化调整的了， 所以建议是各自使用。如果客户想用MA0220里面的PI 检测周期也可以试试，但这个产品具体浓度实验室未公开，客户需要自行摸索尝试了

建议设置正常细胞、PI 单染和 Annexin V-FITC 单染 3 个对照组，这里正常细胞需要染色吗

不染色的，正常细胞可以用于调节电压，PI 单染和 Annexin V-FITC 单染可以用于调节设置补偿

MA0220应该用哪个通道呢？

可以选择FITC和PE通道进行，或者其他相近波段的

细胞数特别多会有影响么？

有影响，常用细胞浓度1×10^6 cell/ml。吸取100μl细胞悬液（细胞总数为1×10^5 cell）至一新管中，加入5μl Annexin V-FITC和5-10μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15min

稀释后的buffer可以储存多久

建议现用现配，剩余稀释后的尽量不要再储存了

cytoflex流式细胞仪这个仪器 MA0220 可以用吧？

可以的

FITC染不上

1.消化时间过长或离心速度过高导致机械损伤，细胞膜破裂，这样阳性PI 会高，解决办法：细胞不能太多，消化时间不能过长，减少反复吹打次数，尽量避免过大机械损伤 2.未彻底去除死细胞或碎片，解决办法阈值设置高一些 可以到10^6；3.染色时间不足或温度不当，解决，可以先加FITC染5min之后在加PI染15min；37℃孵育4.细胞本身：状态和密度都有影响，解决方案：密度一定要摸索好，状态要好，染支原体啥的会影响效果5.binding现用现配，用超纯水，别用PBS

没有无菌去离子水可以用超纯水稀释 binding buffer么

可以的

就是PI和FITC共染过后可以离心清洗一下不。我做的结果不分群

可以清洗后重新检测的，但一般常规是直接用bingding buffer终止染料就行了；不分群一般可能原因：1.消化时间过长或离心速度过高导致机械损伤，细胞膜破裂，这样阳性PI 会高，解决办法：细胞不能太多，消化时间不能过长，减少反复吹打次数，尽量避免过大机械损伤 2.未彻底去除死细胞或碎片，解决办法阈值设置高一些 可以到10^6；3.染色时间不足或温度不当，解决，可以先加FITC染5min之后在加PI染15min；4.细胞本身：状态和密度都有影响，解决方案：密度一定要摸索好，状态要好，染支原体啥的会影响效果；另建议：1.操作注意染色时Binding Buffer需要现用现配，用去离子水稀释，其缓冲液中有可促进染料染色效果2.细胞总数建议在 1×10^5 cell，如果每组细胞数量比较多也会影响染色效果。

MA0220里面的PI，可以用MA0137直接替代吗

不建议

能用多聚甲醛固定吗

不可以，这个是能区分活细胞，早期晚期凋亡的，如果固定了那细胞都死了，就没有意义了

MA0220可以做植物原生质体吗

从原理上和可行性上是可以的，具体最佳条件需摸索尝试了

细菌可以用吗？

不能，测细菌推荐活死细菌试剂盒MA0390

流式检测凋亡的试剂盒几款的区别

区别和选择：货号MA0220，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒比较常用，FITC发绿色荧光，PI发红色荧光。
货号 MA0428 AnnexinV-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒中，将PI更换为了 7-AAD，7-AAD是PI的替代物，其荧光特性与PI相似，也发红色荧光，可被488nm氩离子激光激发，但其发射光谱较PI窄，且发射波长更长，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与多种488激发光激发的荧光染料联合使用，如FITC，PE等。这个可以替代PI，应用到产品中，可以用于阿霉素相关的检测（流式细胞仪，不是荧光显微镜）。阿霉素 发射波长：575-585 nm；7-AAD 发射波长：647 nm，检测通道FL3。
货号MA0429 AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒，选择PE（MB5943藻红蛋白）与annexin 偶联，其中PE 的激发波长为为495,545或564nm ,发射波长575nm,发出红色荧光，在多色荧光分析中，在待检测的细胞已经表达GFP等绿色荧光蛋白的情况下，推荐客户选购Annexin V PE/7-AAD试剂盒。Annexin V PE发红色荧光，PE可以被495nm、545或564nm的激发光所激发，发出峰值为575nm的荧光。

binding buffer稀释后有絮状沉淀是怎么回事?

磷酸盐会和钙结合的，不能用PBS，用无菌去离子水稀释

用显微镜检测怎么做

显微镜拍照检测也是按照说明书操作进行，前面细胞处理染色标记操作都是一样的，后面检测时参考说明书中显微镜检测的方法进行

pi染不上，FITC正常

建议：1.所有样本组请先收集上清液（避免漂浮的凋亡细胞被弃掉），消化下来细胞之后和上清一起离心，2.细胞总数建议在 1×10^5 cell，如果每组细胞数量比较多也会影响染色效果， 3.染色时Binding Buffer需要现用现配，用去离子水稀释，其缓冲液中有可促进染料染色效果，不建议使用PBS等稀释；4.另可以尝试先加PI染10min之后在加FITC共孵育染15min；5.染色后可以先置于荧光显微镜下观察一下荧光染色情况，这样更直观方便。6.流式检测时FCS-H阈值可以设置成10的6次方进行；

已经消化完细胞，但是仪器约很晚，还能补救么？

可以将细胞重悬于完全培养基中，染色前清洗细胞，用buffer重悬在进行染色上机检测；如果已经加了loading了，你加loading buffer里面也可以，阳性率会高一些，但是对照组也高，到时候你对比减一下应该还好，但是一定不要加染料

做海马组织细胞凋亡，制备细胞悬液方法

常用机械法或者酶消化法，文献一般用300目尼龙网进行，预冷PBS冲洗研磨，具体细节可综合参考文献优化

单染是每组都要做一个么？

只做一个，单染最好用凋亡组做，可以做最高浓度药物处理凋亡最明显组的

可以用于活体检测吗，打入动物体内

这款主要是用于细胞样本的凋亡检测，不太适合，动物可以考虑做组织切片，之后用TUNEL检测

PI加多少？

建议量：5-10 μl PI；具体量需要看细胞情况调整

荧光显微镜检测，染色孵育后涂片怎么做吗？

染色孵育后涂片，就是染色完成后，取适量细胞悬液，滴在载玻片上，加抗荧光衰减封片剂，观察即可

想做巨噬细胞的胞葬作用 要看标志物可以用吗

不太适合

如果有mcherry还能用吗

不能用MA0220了，这个波长和pi重叠了；7-AAD激发是546，发射是647，和客户荧光蛋白也太近了，需要客户仪器分辨率很高能区别出这两个光（用不同通道检测收集），否则可能也会干扰重叠的

现在温度比较低，染料孵育条件需要调整吗

可以将培养板置于37度培养箱内，进行染色，15-30min

Annexin V-FITC，PI,Binding Buffer预先混合好一起加入会不会有影响？

bingding buffer的作用是使细胞变成单细胞悬液，一起加，细胞聚集在一起，染色不均匀，咱们都是先加binding，再加Annexin V-FITC和PI

这个试剂盒是凋亡和周期可以同时测出来嘛？

MA0220可以测细胞凋亡，不能测细胞周期，可以搭配MA0334检测细胞周期

第一次用注意事项

1.Annexin V千万不能冷冻，不然效果就不好了 2.操作注意染色时Binding Buffer需要现用现配，用去离子水稀释，不能用PBS 3.细胞总数建议在 1×10^5 cell，如果每组细胞数量比较多也会影响染色效果，4.消化时间过长或离心速度过高导致机械损伤，细胞膜破裂，这样阳性PI 会高，5.阈值设置高一些 可以到10^6;这样能更好更彻底去除死细胞或碎片，6.染色时间温度要控制妥当，如果有哪个染得不好，可以先加FITC染5min之后在加PI染15min；7.做两个单染，如果空白细胞做的凋亡少不明显的话，用凋亡最明显的那组做两个单染，然后在分群看一下；8.上机设置在1万细胞数；9.染色结束后一定要加loading，再去上机

挑细胞么？客户想做THP1单核细胞

不挑细胞，理论上都是可以用的

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒适用于组织切片吗？

可以用于组织切片，如果是新鲜组织，需要固定液固定，做成切片。

Tunel实验，加抗荧光衰减封片剂之后怎么保存呢？能保存多久？

常温，避光放就行；保存时间具体得看荧光，但是荧光总会衰减；一般两三天没问题。

Tunel怎么计算凋亡指数？

在共聚焦下，凋亡率(凋亡指数)的计算方法如下:每个样品随机计数4个视野，按公式计算 凋亡指数(AI)：AI＝凋亡细胞数／(凋亡细胞数十正常细胞数)。统计学方法 结果采用x土s表示，多组样本均数用单因素方差分析，组间两两比较用Scheffe检验，两样本均数的比较用t检验。

怎么设置实验组别

1）阳性组：用DNase I酶处理，诱导细胞凋亡、暴露出3，-OH末端。每次实验做一个即可。
2）阴性组：不加TdT酶，其余操作和实验组相同。每种切片样本各需要做一个阴性对照。比如有5个老鼠的肺组织切片样本，那么就需要做5个阴性组。
3）实验组：除了阳性组和阴性组，所有的样本均是实验组。

为什么设置阳性组、阴性组

1.阳性组：组别染上绿色，既实验方法没有问题。
2.阴性组：a.排除细胞自身凋亡以及操作过程等原因导致的非特异性染色；b.调整拍摄曝光强度。
除此以外，大家或多或少会遇到染色结果异常，包括荧光信号弱、没有荧光信号、假阳性高、荧光背景强等问题。染色失败的原因主要包括样本处理不当、染色不充分、曝光时间过长等，可从以下几个方面对症分析。

荧光信号弱或没有荧光信号（假阴性分析）

1样本处理不当
1）样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点，便于染色。
2）脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ºC 20 min，再使用二甲-苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。
3）Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间，常用时间10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。
4）Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL。
5）放置在-20 ºC保存较长时间的切片不新鲜，减低染色效率。建议使用新鲜切片。
2染色操作不当
1）染色时间过短。建议一般 37 ºC 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。
2）TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。
3）TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导致TdT酶失活。
4）样本干燥。加上TUNEL反应液后，请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行，保证样本均匀染色，又可防止反应液干燥。
3荧光检测操作不当
1）操作未避光。由于荧光易碎灭，建议标记与检测样本时，载玻片要避光，观察时要尽量快。

非特异性染色（假阳性高）

一、样本处理不当
1.使用酸性或碱性固定液，导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。
2.固定液浓度过高，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲-醛溶液（溶于PBS）。
3.固定时间过长，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议控制固定时间在4 ℃放置25 min。
4.蛋白酶K处理时间过长，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当缩短处理时间。
5.蛋白酶K浓度过大，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当调整蛋白酶 K溶液浓度，一般工作液浓度为20 μg/mL。
二、 染色操作不当
1.TUNEL染色时间过长。建议一般是 37 ºC 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。
2.未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片的非特异性染色。

荧光背景强

1染色操作不当
1）TUNEL染色时间过长。建议染色时间适当，一般是 37 ºC 孵育60 min，避免串色。
2）TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数，优化浓度。
3)  使用二价阳离子优化反应， Mg2+可降低背景，Mn2+可增强染色效果。
4）PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片样本中残留的染料。
2荧光检测操作不当
1）曝光时间过长。建议调整曝光条件，先对阴性组调整到无背景光，然后用这个曝光条件去拍摄实验组（可以微调，但是不需要大调）。

TUNEL试剂盒主要成分及功能

1.FITC-12-dUTP Labeling Mix：标记3′-OH末端和作为TdT酶的底物，和相应的buffer，用于维持一定的反应条件，缓冲液中的Mg2+降低背景，Mn2+增强染色效果。
2.蛋白酶K（Proteinase K）：通透细胞膜和核膜，保证TUNEL探针进入细胞中，保证染色充分。
3.TdT酶：催化dUTP标记3′-OH末端的关键酶。
4.DNase I：用于消化完整的DNA产生3‘-OH末端。

DAPI 核染色正常，但 TUNEL 荧光弥漫的可能原因

一、TdT 酶非特异性标记细胞外 DNA 碎片（最可能）
原因：
1.组织中存在坏死细胞，细胞膜破裂释放 DNA 碎片，TdT 酶将荧光 dUTP 结合到细胞外的 DNA 断裂末端，形成弥漫性背景。
2.切片处理时机械损伤（如切片过厚、展片温度过高）导致细胞破裂，DNA 泄漏到间质。
二、封闭不足导致试剂非特异性吸附
原因：
1.未有效封闭组织中的蛋白结合位点（如胶原、纤维蛋白），TdT 酶或荧光dUTP 通过静电作用吸附到细胞外基质或胞质蛋白。
三、TdT 反应液浓度过高或孵育时间过长
原因：
1.过量的 TdT 酶不仅结合凋亡细胞的 DNA 3’-OH 末端，还会非特异性结合单链 DNA、RNA 或断裂的染色质（如坏死细胞的 DNA 断片）。
四、洗涤不彻底，残留荧光标记物
原因：
1.TdT 反应后未充分洗掉未结合的荧光 dUTP，使其吸附在细胞表面或间质中。

阳性对照没有信号是怎么回事

可能原因是DNase I 的浓度过低。优化方案：冷冻切片使用 10-15µg/ml 的 DNase I；石蜡切片使用 15-25µg/ml 的 DNase I；细胞样本使用 5-10µg/ml 的 DNase I。

显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞怎么办

1、组织切片粘附之前的包被不充分。在展片之前，用3- 氨 丙 基 三 乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，TESPA) 包被比多聚赖氨酸(poly-L-lysine) 效果更好。
2、在操作过程中丢失大量细胞。（1） 提高起始的细胞量。（2） 在制备贴到载玻片的细胞悬液时，离心过程中用含1%BSA的 PBS 洗细胞。（3） 在制备细胞悬液时，离心过程中用含1%BSA的PBS洗细胞。（4）降低蛋白酶 K 的通透时间，防止酶把细胞消化下来。

MA0223和MA0224两款的区别

两款作用原理，操作等类似，主要是标记的荧光染料颜色不同，MA0223为绿色荧光的，MA0224为红色荧光的

tunel一定要当时看么？可以晚几天看么？

12小时以内拍，如果能加抗荧光衰减封片剂的话应该可以2-3天，也看封片剂，有的封片剂可以稳定1周

tunel试剂盒，可以先固定上等几天再做吗？

可以，但尽量放置时间不要太长，第二天做一般是没问题的

tunel试剂盒精子可不可以用

有文献报道使用的，如需进行建议先小试摸索

tunel试剂盒检测细胞凋亡实验，488跟Dapi通道重合

一般这个情况有可能是串色影响,一般如果绿光和蓝光完全重合是串色影响比较大，或者您可以选择用红色款的TUNEL，这个激发和发射波段，和DAPI的比较远，相比下不容易串色干扰,或者可以看下滤光片最佳激发发射波长，换个显微镜拍摄看下效果；如果其拍摄到的绿色荧光有部分是假阳性影响，这样情况有可能会和样本处理不当，比如抗原修复，或者固定液ph值或者通透处理时间作用浓度等有关，这样会导致细胞自溶、破坏核酸结构，DNA链不规则断裂从而影响结果

tunel试剂盒可以用多少次

以50μl加样量为标准，MA0223-1可测定20次，MA0223-2可测定50次。96孔板的一个孔，所需体积是50μl，对于表面积更大的样本（如48孔板、24孔板、12孔板、6孔板的一个孔），可成比例的增大试剂体积。

tunnel染色试剂盒，想跟我的抗体共染可以吗

如想tunel和免疫荧光一起进行，可以尝试先做TUNEL，之后再进行免疫荧光抗体孵育等,但上述这个情况有可能会导致TUNEL结果出现假阳性，建议最好分开进行，如果想尝试建议先预实验摸索优化下条件

tunel试剂盒说明书上没写可以染核，还能染核么？

可以呀，直接染完tunel加dapi就行，但是我们试剂盒里面不带染核的染料，需要您自己准备，或者直接买个带dapi的抗荧光衰减封片剂，这样还能维持荧光还能染核

tunel试剂盒做切片脱蜡会更好吗

咱们自己做的时候没有烤片，就是直接放二甲苯脱蜡的，能脱干净，如果客户担心，可以烤片充分脱蜡和水化（但是拷片容易造成假阳性）。脱蜡前可先将切片在 60ºC烤片 20 min，再使用二甲苯脱蜡2次，每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，便于后期试剂能充分、均匀的结合反应。

tunel试剂盒，冰冻切片沉糖操作会不会对凋亡检测有影响

一般不会，沉糖后可以继续做tunel的

tunel凋亡检测，是原位检测吗？

如果是贴壁细胞，是的，可以在孔板或爬片，直接固定，通透，染色

tunel凋亡检测，固定后在4℃在4%多聚甲醛过夜可以吗

正常可以固定后放置在PBS中过夜可以的，不过固定时间长了容易出现假阳性

tunel凋亡检测，我想用流式检测，是贴壁细胞，应该怎么做

先把细胞消化下来，然后按照说明书中悬浮细胞步骤进行染色

tunel凋亡检测，可以用流式吗

细胞悬液可或者新鲜的组织做成单细胞悬液可以用流式检测

tunel凋亡检测，新鲜的组织切片要怎么预处理

切片做好之前，用生理盐水或者PBS清洗后按说明书进行固定往后做就可以

CCK-8检测，这个如果及时测，不需要终止液，直接把cck-8吸出来就行吗？

对的，不需要终止液
正常做完就测的话不需要终止的，终止液是暂时不测定吸光度，需要加，7天内保证吸光度不变的

CCK-8检测，孵育时间怎么确认？

普通贴壁细胞一般半小时左右肉眼可见变色即可测了，第一次做的话可以摸索一下，吸光度OD值在0.1-2.5都可以，最佳是对照组的OD值在1.0左右

为什么测量CCK8的数值总是很高？里面这边CCK8的OD值一般在哪个范围？

cck-8中OD值范围：0.2-2.5之间；如果给药组高的话可能是时间长了，一般贴壁细胞半个小时左右，出现肉眼可见的黄色就可以测了，时间长了会有代谢，如果是最后算值减去空白组还特别高，那么看看给药浓度是否合适

CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养0.5-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。超强型CCK8灵敏度更快反应更快，更适合悬浮细胞等孵育时间较长的细胞类型。

哪些物质会影响CCK-8的测定？

当有氧化还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，因此当所加药物为氧化还原性物质时需要换液再进行检测。

CCK-8试剂盒如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，一般还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

CCK-8试剂盒铺板细胞量有什么要求吗？

96孔板细胞计数的时候一般是10^4，我们铺96孔板，细胞浓度是5*10^4，取100ul铺板；可以您自己对细胞计数，保证每孔细胞数量一致。或者可以计数，方法：按不同细胞数铺板，贴壁后加cck，孵育一定时间后检测，对照组OD值在1.0-1.5左右是最佳铺板数

CCK-8试剂盒细胞能一边培养一边检测？

CCK-8本身几乎无细胞毒性，培养一段时间测CCK-8，然后换液后可以接着养。

做CCK-8经常有气泡，对吸光度有影响，有什么办法去除吗？

可以避免有气泡，加药时枪头抵着孔壁，慢点加液体，基本不会产生气泡，如有条件可将96孔板离心，这样气泡就会消失。

CCK-8试剂盒每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

可能会有以下几个原因：
1)当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
2)有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。
3)每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000~100,000个/孔范围内摸索条件。
4)重复试验请保证孵育时间、接种细胞数相同。

CCK-8会导致细胞死亡吗？

CCK-8本身对细胞毒性特别小，作用时间长不会导致细胞都死亡，但是细胞长满了，本身代谢会引起细胞死亡

CCK-8除了用酶标仪还可以用什么仪器？紫外分光光度计行吗？

般CCK-8都是用酶标仪，紫外分光光度计操作起来比较麻烦，而且检测时间很长，CCK-8对孵育时间敏感，这样误差太大了

CCK-8试剂盒OD值偏高？

可以确认下培养时间，一般肉眼可见颜色变化后检测，适当缩短孵育时间。

CCK-8试剂盒中货号MA0218和MA0225的区别

美仑超强型CCK-8试剂盒（MA0225)和普通或增强型CCK-8试剂盒（MA0218）相比，检测速度更快、灵敏度更高、线性范围更宽，仅需0.5至1小时即可完成检测，尤其适用于悬浮细胞。同时保持数据可靠、重现性好、稳定性好的特点，可以广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

CCK-8试剂盒和EDU试剂盒区别

如检测单个药的毒性推荐EDU，EDU检测增殖最准确的方法，因为其是检测DNA合成情况的，cck因为伴随代谢，有些药物影响到代谢，所以有时候最后测得的抑制率并不一定是和细胞毒性成正比的；但是DNA变化是准确的，而且可以用于流式。
如前药物筛选化合物多的话建议用CCK-8，因为EDU操作步骤比较复杂，不适合前期药物筛选，CCK-8反应速度快，操作简单，适合前期实验。

说明书中的标曲必须做吗

可选项目，可以根据实验需要进行选做，具体操作可详见说明书“（一）制作标准曲线”

怎么计算细胞活率/抑制剂？

细胞存活率 = [(As – Ab)／(Ac – Ab)] ×100%
抑制率 = [(Ac – As)／(Ac – Ab)] ×100%As：
实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物）的吸光度Ac：对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物）的吸光度Ab：空白孔（不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8）的吸光度

脱氢酶指的哪个？如果药物具有抗氧化性是否对CCK-8反应机理有影响？如果找到药物对应的脱氢酶的辅酶，是不是就可以排除影响，继续使用CCK-8？

（1）NADH脱氢酶，原理：凡是有NADH的可以把H给电子载体EC,EC还原成EC-H,这个还原的EC-H到胞外和WST-8反映，把H给WST-8,WST-8还原为Formazon。所以NADH越多，那些脱氢酶就越多，脱氢酶包括：苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶。NADH属于递氢体。（2）药物有抗氧化性，会影响，如果您就想测这个药对细胞增殖的影响的话，可以用EdU方法。(3)药物具有抗氧化性，抗氧化性的话会使CCK-8吸光度结果偏大，即使找到对应的辅酶，不相关，这样结果也是不准确的。

CCK-8试剂变成橘黄色还能用吗

正常是粉色的，变色后会影响效果，建议使用新一支

CCK-8怎么添加？

按照每孔10%的量添加CCK-8，比如孔内有90ul培养基，可加入10ul CCK-8试剂

高浓度药物组，加完药培养基就有些橙黄色，这样会不会影响测试结果？

若担心受试化合物有影响，可在加 CCK-8 之前除去原培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基，以去掉药物影响。

cck-8的线性范围是多少

测吸光度，OD值 0.1-2.5都可以，最佳是对照组OD值1.0左右

24孔板怎么做cck-8

操作的话还是按照说明书进行哦，用量的话，一般CCK-8添加量为10%，比如24孔板，您的培养液是500ul，需要加50ul cck-8。作用时间0.5-4小时，具体得看是什么细胞什么实验，贴壁细胞一般孵育半小时左右可以看一下染色变化，悬浮细胞孵育时间要长一些。可以测吸光度，0.1-2.5都可以，最佳是1.0左右。如果必须24孔培养，96孔板检测的话，如果可以的话，也可培养后从24孔板取100ul，加至96孔板，在96孔板中加入CCK-8,，进行孵育，再正常检测。

悬浮细胞一般接种密度？如果药物对CCK8颜色变化有影响，怎么办

细胞计数的时候一般是10^4，我们铺96孔板，细胞浓度是5*10^4，取100ul铺板.5000个/孔。如果培养时间比较长，且细胞体积小，也可以做一下预实验，摸一下合适的接种密度。如果药物对CCK8有影响，对于颜色改变有影响，可以将悬浮细胞离心，弃去药物，以换液的形式加入CCK8，以避免药物影响。

CCK-8产品我看说是避光保存，为啥瓶子是透明的呀

咱这款包装做了升级，和进口包装类型。是透明瓶，外面是个铝箔纸的袋子，客户储存别把袋子扔掉就行。

做CCK-8测了吸光度在3点多，是不是孵育时间太长了

时间有点长了，OD值 0.1-2.5都可以，最佳是1.0左右（对照组），可以缩短一下孵育时间，贴壁细胞，一般半小时或者1h看一下颜色变化，测一下OD值

没有细胞只有血清的培养基CCK-8加入450检测OD值是多少

0.1-0.2左右，会根据培养基类型等有所区别

CCK-8检测，显微镜下看到细胞死了但是测出来还比正常的细胞高是怎么回事

CCK-8在遇到显微镜下看到细胞死了但是测出来还比正常的细胞高，这个客户可以看下药物是否有氧化还原性或者有颜色干扰检测的，为了避免药物干扰，建议可以以换液形式加入CCK-8进行，然后还需要注意下客户的药物是否有吸附性，就算容易黏附细胞表面换液除不掉哪种，这种如果药物有影响换液也去除不完全，可能还有会影响；同时，如果客户担心试剂问题，可以先看下CCK-8原液的颜色，正常是粉红色的，如果变色可能效果就不好了；另外客户也可以做下此细胞不同密度下的cck-8检测，比如2500，5000，7500，10000个细胞这样，看下CCK-8检测是否随着细胞数量增加而增大，从而排查下

CCK-8产品不用的话可以放-80度吗

不太建议，2-8℃避光保存，一年有效。-20 ℃可以储藏更久，但反复冻融会增加背景值，干扰实验测定，因此请将经常使用的试剂保存在2-8 ℃。

CCK-8检测，赋予时间怎么确认，然后IC50值怎么算？

不同细胞不一样赋予时间，可以根据肉眼可见颜色变化，优先粉色变成橘黄色就可以测，OD值对照组在1.0-1.5就可以用，值的话就按照公式细胞存活率 = [(As – Ab)／(Ac – Ab)] ×100%，得到存活率，放到SPSS或者grafpad软件上，选择显示IC50

CCK-8检测，我药物是用DMSO溶的，没在安全剂量范围内，控制单一变量可以把空白孔和对照孔都加DMSO么？

这么做是可以，或者建议空白孔和对照孔不动，然后多做一组和你药物组一样含量的DMSO的组，之后算值的时候减去就可以了

CCK-8检测，孵育4个小时了，之后咋弄

设置检测波长450nm，参比波长 600-650nm（非必须）。如果没有 450nm 的滤光片，也可以使用吸光度在 430-490nm 之间的滤光片

2D细胞成球实验，已经成球的细胞还能做CCK么？

不太建议，因为球里面的细胞会反应慢，不同大小的细胞球cck会有误差。如果想做需要先把细胞球解开，或者更推荐使用CellTiter-Meiluncell 3D发光法细胞活力检测试剂盒 货号：PWL207

CCK-8检测，细胞污染了，而且孵育时间有点长，所有组值都很大啥情况

细胞污染，如果污染的菌可以参与三羧酸循环，如大肠杆菌可以参与反应，数值也会变大

CCK-8能做菌类检测吗？

大肠杆菌可以用，需要菌类可以参与三羧酸循环才行

CCK-8检测试剂盒里面有几种试剂？1000T是多少ml？

就1瓶试剂，1000T 10ML

CCK-8重复性差

几个点您参考一下，1、细胞尽量每个孔铺均匀，并且注意细胞状态，细胞状态不同会造成代谢率不同。2、您是换液方式加入研究药物，所以换液时候注意不要吸到细胞，以上两点会因为细胞数不同，造成od值不同。3、加入cck-8试剂不要产生气泡，加入后可以轻敲板混匀，4、检测时，可以选择双波长检测，减少由于板子有划痕等问题产生的误差。5、检查您的研究药物，是否是研究药物存放了一段时间，药物储存问题导致药效降解什么的，对细胞的作用程度不同。我看您的对照和空白，两组相比的话其实差不多的，主要是加药组值查很多，所以首先看一下药物影响，您的药物不是没有颜色，也没有氧化还原性么，这样每次您实验前都现用现配，可以保证药物活性。

加cck-8之前用不用把药吸走？

如果药物没有氧化还原性就不用吸走，但是如果有或者带颜色，就换液形式加

cck-8能不能用1%sds去终止显色反应？

可以的，1%SDS或者0.1M HCl都行

如果细胞液是200uL的话，咱们的CCK-8是不是要加20uL？

CCK-8添加量按照10%占比添加，如果细胞液是200uL的话，咱们的CCK-8加20uL

值只有0.2，太小了

酶标仪检测OD值太低了，基本和培养基本底值差不多，可以在延长孵育时间，一般OD值在0.1-2.5范围比较好的；对照组OD值在1.0左右；
如果没有 450nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490nm 之间的
滤光片，但是 450nm 检测灵敏度最高；
如您的药物有颜色和氧化还原性，建议换液形式加入CCK-8，避免药物对反应的干扰；

10ul那么少咋加

不是把培养基吸出去，直接加10ul的cck-8，就不加培养基了，是在培养基里面cck占比10%，如果药没有影响的话不用换液，在原有培养基里面加10ul的CCK-8,如果药有影响就原有的弃掉，然后配一个含10%cck-8的培养基，一起加细胞

小鼠原代肝细胞能测的出来吗？

可以，cck-8不分细胞种类，都可以用的。主要需要一个加入cck-8的培养时间的确定，需要客户摸索一下。不同细胞显色难易度不同。

cck-8能做真菌吗？

真菌测不了

这个细胞给药一定24小时在加cck么

不是的，细胞给药时间是您自己的实验设计，看您药效，也有做6小时，8小时，12小时，48小时的等，得看您具体药物作用情况，建议可以先根据文献设置不同时间梯度验证最佳时间和浓度

不小心 CCK-8 加多了

如果还没有孵育的话可以再补加培养基，使CCK8终浓度10%，之后进行孵育检测；控制浓度10%可以，比如100ul培养基，加10ul CCK8，则200ul培养基，可以加20ul CCK8进行

双波长检测是什么意思

双波长检测 检测的时候设置450nm 参比波长选择600-650nm就可以，CCK-8在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了除去由于样品本身所带来的吸收。

cck-8如果过几天再测可以吗 要怎么保存

向每孔中加入 10μl 自己配制的 0.1M HCI溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下，在 24 小时内吸光度不会发生变化。或者放在4℃应该也可以的，4℃环境下，细胞也不进行代谢活动了，就自然终止反应了。

能测同一个孔不同时间，最好能24h持续测的活细胞？

可以选用CCK-8检测，检测之后再更换为新鲜培养基培养细胞，这个毒性很低，一般不影响细胞后续增殖，但需要全程无菌操作

测的cck-8都是overflw

overflw就是已经达到酶标仪检测上限了，所以没有出具体数值，建议后续测试可以缩短些孵育时间或者适当减少细胞数量。比如CCK8检测时一般普通肿瘤细胞系可以96孔板接种5000-10000个/孔，对照正常组OD值在1.0-1.5范围孵育时间就比较合适了，如果超过3.5有的酶标仪可能就over检测不到数值了

可以孵育后吸取上清检测吗，测得值有差异吗

可以的，值会有些差异，但扣除本底值后的趋势都是一样的，不影响结果趋势的，比如随着细胞毒性药物浓度记录的升高细胞活性降低。另移去过程也易引入误差，操作使使用排枪，可以多做几个复孔优化控制

测细胞活力的 试剂盒 CCK-8可以吧

可以

厌氧条件下CCK-8是不是可行

一般这个没有要求，CCK-8检测依赖于细胞内的脱氢酶活性

检测细胞数推荐：

检测时每孔的细胞数量在 5万个以内（如使用 384 孔板宜控制在 1 万个以内)，检测效果因细胞的种类不同而有所不同，对于一些 ATP 含量特别高的细胞，在细胞数量达到 50,000 个后可能会不呈线性相关，但化学发光读数还是会继续升高。

检测仪器和波长条件：

可使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测，全波长扫描。每个孔的检测时间一般为 0.25-1 秒或更长时间，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。

能否用于细菌检测？

不建议用于细菌类检测，裂解效果可能不是很好，这款主要用于细胞方面。用于细菌检测推荐使用CellTiter-Meiluncell 3D发光法细胞活力检测试剂盒 货号: PWL207

能否用于类器官检测？

这款主要用于2D细胞方面，3D细胞或者类器官等推荐看下我司CellTiter-Meiluncell 3D发光法细胞活力检测试剂盒(货号:PWL207)

对于不同的细胞，检测灵敏度是否一样？

不完全一样，因为每种细胞含有的ATP是有差异的。像Expi 293细胞，同样细胞数时，它的发光值比其他细胞高2-3倍。但是同一种细胞的ATP含量是比较稳定的，所以我们试剂盒的检测结果是准确的。

如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中直接加入检测试剂，测定出的发光值即为空白对照。

加样时有气泡，对发光值有影响，有什么办法去除？

我们的体系里已经含有消泡剂，可以避免产生气泡，但是大家最好向孔里加入药品时用枪头抵着孔壁，缓慢加液，这样基本不会产生气泡。

检测不到信号是什么原因，怎么解决？

原因主要有以下两点：一是检测孔板中没有加细胞或者加的溶液里，细胞全都死了，这相当于没有ATP，所以检测不到信号；二是检测仪器设置存在问题，应调整增益大小，提高检测灵敏度。解决方法是：设置阳性对照，可以配制不同浓度ATP进行检测，如果有信号，说明试剂和仪器设置没有问题，可能是样品存在问题；如果没有信号，可以尝试调节仪器增益，检查仪器是否好用。

信号比其他品牌低

我们的产品对每种细胞的灵敏度是存在差异的。对于大多数细胞而言，我们的信号与同类产品相近甚至比其他品牌高，但对某些细胞的信号有可能出现比其他品牌低的情况。但我们的产品在对细胞浓度的检测上，线性关系没有问题，对检测结果是不会造成影响的。

裂解产生的碎片影不影响数值？培养基种类是否影响结果？

不会影响，我们的试剂是检测细胞中的ATP浓度。我们的试剂裂解细胞能力较强，裂解后细胞碎片很少，不会影响检测结果。我们测试过常用培养基，如DMEM，RIPA 1640，化学成分确定的无血清、无蛋白培养基等，对检测结果是没有影响的。

细胞代谢会有ATP酶，影不影响检测？

不会影响检测。虽然每个细胞代谢都会有ATP酶，但我们的试剂里已添加了磷酸酶抑制剂，可以有效抑制ATP酶活性，减少其对检测的干扰。

官网做的标曲10万细胞也挺好，但说明书说建议5万以内

是的，对于一些细胞系我们检测过10万数量细胞线性很好，也可以测到20万，但20万细胞线性就不太好了，考虑客户的细胞类型各异，稳妥起见说明书建议是5万以内以保证其良好的准确性，如果您实验需要更多细胞数，也可以测试标曲先看下线性的，如果线性良好则可以按需进行

可以干冰和冰袋运输吗，白色板子的底部透光还是不透光的

干冰运输的，可以选择全白色不透光的或者底部透光四周白色不透光的均可

PWL214 PWL111针对检测细胞数量有区别吗？

一样的，这两款要求细胞数都是 96孔板 每孔的细胞数量在5万个以内，384孔板宜控制在1万个以内

可以稀释用吗

可以，测试过减量至五分之一效果也是良好的

和Promega的步骤是一样的吗？

是的，方法都是类似的，替换比较方便

CTG冻融过一次后 再放-20就一直是液体状态 就不会再冻住了 是正常的嘛

正常是能冻住的可能是冰箱温度没有达到-20℃以下 有可能出现这种情况 可以拿出来摇一摇 再冻看看 保持低温应该不会有影响

CCK都能替换成CTG么？

可以，但ctg测完细胞都死掉了，不能接着养

震动板子是在哪里进行

震动板子可以在酶标仪中进行，设置中等震动2-5min，具体根据细胞裂解情况看

这个用什么细胞培养板，检测时候怎么计算

检测时建议使用适合于细胞培养的白色或黑色的 96 孔板或 384 孔板。如果使用普通透明的 96 孔板或 384 孔板，相邻孔之间会产生相互干扰影响结果。
检测公式可以按照cck-8公式进行，设置空白和对照组; 或者或根据 ATP 标准曲线计算出 ATP 的量从而计算出细胞的相对活力，但咱试剂盒里面没有atp标准品，需要客户自备。

细胞超过5万好多，这个有影响吗，实验组都在数量可控范围内的

建议确保检测时每孔的细胞数量在 5万个以内，检测效果因细胞的种类不同而有所不同，对于一些 ATP 含量特别高的细胞，在细胞数量达到 50,000 个后可能会不呈线性相关，但化学发光读数还是会继续升高

细胞做慢病毒转染，带绿色荧光蛋白，还能用么

理论上转染病毒一般会带GFP;GFP需要激发，而荧光素酶反应会直接发光，所以应该不干扰

测死细胞的？像LDH?

LDH测得是死的细胞，咱家CTG，CCK，MTT测得是活细胞

如果加入胰酶消化，是否对检测结果有影响

胰酶会影响效果，不需要加胰酶，按照说明书正常操作，正常加ctg，只不过在等要检测前，转到白板或黑板里就行，不干扰检测就行，就是多一步转移的过程，加完CTG细胞就裂解了，到时候直接把裂解液整体转移出来，含细胞碎片

PWL111和PWL214区别/不同？

PWL214是PWL111的升级产品，效果上与进口的P品牌对标竞品更加接近，如果是进行替换P品牌使用，优先推荐PWL214。
萤光强度：PWL111较PWL214略高一些，因此细胞量少，或者希望获得强阳性结果的客户，可以推荐PWL111。
室温稳定性：PWL111稳定1小时左右，PWL214可以稳定4小时，如果需要连续实验，批量处理样本，分批检测的客户推荐PWL214，更加稳定。
孔间平行性：PWL214的孔间差异会更小，更加适合刚刚开展实验的，第一次使用的客户，可以一定程度避免操作引入的孔间差，获得一致性更好的结果。
价格：PWL111的价格略低于PWL214，在均满足实验条件的情况下，PWL111更加经济。

MA0424、MA0425、MA0426三款产品区别

三款的原理。操作方法都类似，MA0424是绿色荧光，MA0425是橙红色荧光，MA0426是红色荧光

EDU试剂盒可以用于组织吗？

本试剂盒适用于培养的细胞或组织样品，也适用于组织切片，可以检测到细胞或组织样本中的单个增殖细胞，也可以对细胞或组织样本总体的细胞增殖情况进行定量分析

细胞本身带绿光，488的EDU试剂盒还可以么？

不可以，建议用MA0425或MA0426.避开干扰

已经是石蜡切片了还能用EDU试剂盒么？

已经制备完石蜡切片那就不能用，因为edu需要在活细胞增殖的时候掺入DNA，得是活体的时候注入，之后再做成石蜡切片

EDU细胞检测，实验当天做不完了怎么办

固定后放置在PBS里面 4℃储存，明天继续做后面的

EDU做完去做流式，结果488和Cuso4忘记放冰箱了，有影响么？

488-azide会有影响，荧光变弱

EDU试剂盒中，3%BSAPBS，3%BSA作用是什么，一定要加么？直接用PBS可以么？

3%BSA作用封闭稳定荧光，如果没有也可以用PBS替代，但效果上用含BSA的会更好

EdU染色之后，先用荧光显微镜测一下，再进行细胞核复染，再测一次呢，还是胞核染好了一起测就行？

都可以，可以染完edu，先用显微镜看下，然后在核复染，再看下；也可以染完edu，直接染核，然后在不同波长刺激下看。

EDU实验，染完了要立即用荧光显微镜观察吗，可以放着先不看吗

最好立即看，因为荧光有猝灭，如果想保存一段时间可以加封片剂，但是也建议先看一下在加封片剂，在观察

EDU实验，洗涤液通透液怎么配？

洗涤液是3gBSA加100ml的PBS；通透液TritonX是液体，也就是0.4ml到100mlPBS

EDU实验，阴性对照必须做吗？提前处理是在什么时候

是可选做的，建议做会更好。基脲(Hydroxyurea)（MB1307）为 DNA 合成抑制剂，经过 10mM 羟基脲提前 30min 处理的细胞，绿色荧光阳性的细胞几乎完全消失，因此常被用作 EdU 实验的阴性对照，如果有条件可以做一下，接板后，过夜培养细胞，先药物作用30min，然后标记EDU。

做的原代细胞一般EDU孵育多久合适

该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间，一般肿瘤细胞我们孵育2h，您可以参考一些资料看下这款实验细胞的细胞周期大约多少，做下预实验看下情况

EDU实验，带-luc细胞能不能用？

理论上可以的

EDU试剂盒，这个96孔板能做多少次

96孔，按照每孔50ul 反应液，大约可做550次，计算如下：如普通规格50-500T这个，里面488-a组分是55ul，则按照如下方式配置反应液，55ul约获得27.5ml总体积反应液， 96空每孔50ul，约可以做550孔

冰冻切片样本EDU的用量

EdU具体用量与动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此建议用户在预实验中设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳浓度。推荐用户以50mg/kg的EdU初始浓度进行摸索优化。

EDU实验，可以做体内注射吗

eud试剂盒可以用于动物体内注射，冰冻切片检测，不过试剂盒里的EUD量比较少，做动物实验时需要更多的 EdU，如需单独采购粉末可以看下货号：MB3074

EDU实验，最后一步染核，可以将Hoechst33342换成DAPI吗

可以的

是否EDU可以对中性粒细胞进行染色呢？

理论上EDU可以标记染色中性粒细胞，但EDU是标记增值细胞的，中性粒细胞比较难增殖，所以可能标记效果不太好。

可以直接加EDU配置成1×的吗

在原培养基中直接加EDU，配置成1×也可以，通常是建议2XEdU工作液，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。或者可以增加EdU的浓度并减少工作液的体积，例如2ml培养液中加入220μl 10XEdU工作液(100μM)。二步稀释配置方法会更均匀更准确。另更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议更换所有的培养液。

EDU试剂盒中，Click-iT Additive Solution 融化后有白色物质析出还能用吗

Click-iT Additive Solution 融化后有白色物质析出为正常现象，请上下颠倒几次，待全部溶解后使用。溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解，不能再使用。

EDU可以和细胞骨架一起染色做吗

细胞骨架常用染料Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应，在检测细胞微管时请选用其它探针。

EDU试剂盒里自带阴性对照吗

试剂盒中不带阴性对照的试剂，如果做的话可以购买我司MB1307进行

EDU能做悬浮细胞么，最后制片拍照怎么拍呀？

可以做的，就是操作中繁琐些，每一步都需要离心；用配的洗涤液重悬，取10ul，将细胞悬液滴在载玻片一端，用另一张边缘光滑的载玻片以40°夹角推匀，不用烘干或者晾干，然后把抗荧光衰减封片剂滴加到细胞上，然后盖上盖玻片，尽量避免气泡，就可以拍照了

EdU染色信号弱或无信号的原因？

可能原因：
EdU孵育时间不足或浓度过低。
检测染料浓度或孵育时间不当。
细胞增殖活性低，导致S期细胞数量不足。

EdU染色背景信号过高的原因？

可能原因：
染色过程中未充分洗涤。
染料浓度过高或孵育时间过长。
细胞固定或通透化步骤处理不当。

EdU实验用什么仪器检测

荧光显微镜、荧光酶标仪或者流式都可以

LDH检测血清会影响结果吗

动物血清中的 LDH 活性较高时，可以通过降低血清浓度来减小其中的 LDH 造成的背景吸收，一般有两种解决方法：①将血清浓度降低到 5%会显著减小背景而不影响细胞活力。不推荐用1%BSA来代替血清检测细胞介导的细胞毒性。②使用灭活血清，这样血清中的 LDH 背景会大幅度下降。

LDH检测，样本处理好当天测不上怎么办

待检样品准备好后建议当天完成测定，如果暂时无法测定，则请置于 2-8℃，可放置2-3 天。不建议置于-20℃，会使样品中部分 LDH 失活。

LDH检测，加入终止液可以放置多久检测

未加终止液时，随着时间延长，吸光度会逐渐增大。加入终止液后，显色可以避光稳定保存48小时。

LDH检测，酶标仪没有490nm波长怎么办

如果酶标仪没有 490nm 滤光片，也可以使用 450nm 滤光片，吸光度会高于490nm。

LDH和CCK的关联性？

CCK-8 以细胞活性为指标，本试剂盒以游离的 LDH 为指标，两种指标检测存在差异性，二者联用，能更全面的表征细胞毒性。

LDH检测，药物有氧化还原性会干扰结果吗

如果待测体系中存在氧化还原物质则可能会干扰检测结果，还原性物质会使吸光度增加，氧化性物质会使吸光度减小，因此应需设法去除这些物质的影响。

LDH检测，96孔板最外测一圈可以作为检测孔吗

当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。

这款LDH试剂盒，可以对定量LDH检测吗？

可以的，如果需要进行LDH的绝对定量，需自备不同浓度的LDH标准品（如0、65、125、250、500、1000mU/mL）（货号MB2838-乳酸脱氢酶）。有标准品的吸光度后，可以根据标准品制作出标曲，之后测试实验组的OD值，对应代入标曲测试得到的公式中，则可以得到对应实验组LDH量。

做LDH释放检测方法没有在说明书中体现？

做LDH释放实验参考说明书中“检测方法2：低损伤法”的方法进行操作即可。

LDH检测试剂盒，检测人和鼠的细胞都可以吗？

都可以，只要是检测细胞的ldh释放的，任何来源细胞都可以的。

LDH检测试剂盒有标准品吗

试剂盒里不带，可自备 MB2838

LDH检测试剂盒可以测组织吗

需要将新鲜组织制成单细胞悬液之后 再进行检测

LDH检测，加的是硒化铜，这个对于试剂盒会不会有影响呀？而且药物有颜色

考虑药物特性和有颜色干扰，建议实验过程中做个药物对照组，扣除下背景干扰

LDH检测，高对照over咋整是怎么回事？

OVEr就是超过检测上限了，仪器检测不到了，这个情况您可以适当减少细胞数，或者暂时不想动细胞数可以减少孵育时间

LDH检测，做免疫细胞杀伤靶细胞实验分组设置

分组也是如说明书表格内容的；
培养基背景孔 = 背景blank 组
培养基最大释放孔 = 高对照blank 组
效应细胞自发释放孔 = 样品blank 组
靶细胞自发释放孔 = 低对照 组
靶细胞最大释放孔 = 高对照 组
实验组：效应细胞+靶细胞 孔

AM PI浓度 咱们有推荐么?

由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，建议通过说明书的操作自行摸索一下
咱们做的L-929细胞，常用剂量是2 μM calcein AM 和8 μM PI

这款操作中，染色前要清洗，那死细胞已经悬浮，洗完就丢掉了啊，实验数据还准确吗？

如果细胞严重死亡，飘的多的话就按照悬浮细胞法染色；将悬浮部分吸出来，然后贴壁部分消化下来和悬浮部分混一起

活死细胞染色可以放多久

荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用本试剂盒的过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。建议染色后尽量当天完成检测。如果您中间有事想间隔1-2h也可，尽量染完提早观察拍摄，荧光会随着时间慢慢衰减。

用含血清培养基配探针可以吗？

血清对探针有影响，对荧光检测有干扰;血清里面有酯酶，会影响calcein荧光；用无血清培养基配置吧

我在共聚焦显微镜下能同时看到，相同的位置同时出现活细胞和死细胞的染料

在荧光显微镜下使用 490±10 nm 激发波长下同时观察活细胞（黄绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。另外使用 545 nm 激发波长单独观察死细胞。正常490激发，用蓝色通道那么就只能看到绿色荧光，用绿色通道就只能看到红色荧光，如果看到窜色，那么是显微镜通道波长范围太宽导致的，是显微镜的问题。如果是利用共聚焦等可以设置具体波长或者某些荧光显微镜波长比较窄的可以避免串色情况。也可以更换流式检测，可以通过调节补偿来调整荧光溢漏情况。另如浓度太大了也可能，您按说明书做的浓度梯度筛选一下，使两种染料互不干扰，染核的别染上质，染上质的别染上核，每个细胞最佳浓度不一样

可以染色固定么？

不建议，固定细胞就都死了，都变成红色了，活死细胞染色不能固定的

工作液可以储存吗

工作液现用现配，以保证其稳定性。

3D培养可以用么？能透过基质胶么

直接3D检测可能不太行，支架解离后可以用

可以做流试吧，通道怎么选择

用FITC和PE通道

染色后可以固定吗

这款不建议染色后固定，要活细胞进行染色后尽快观察

我如果在24孔板里能用多少次呀？

如果是MA0361-500T 规格，按照工作液Calcein AM 的浓度为 2 µM，PI 的浓度为 8 µM计算，24孔板大约可做200个孔

能用于细菌嘛

本试剂盒可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞，但不适用于细菌和真菌。细菌活死检测推荐我司MA0390试剂盒

Calcein, AM/PI细胞活死双染试剂盒可以用激光共聚焦来检测吗？看说明书里只提到荧光显微镜、荧光酶标仪和流式细胞仪检测。

可以的

可以不用爬片，盖玻片吗

可以，如果是贴壁细胞可以直接接种于孔板中，进行染色孵育观察的，也可以用无血清培养基稀释探针染料进行孵育，加染料前请充分清洗残留的酯酶

加入染色后细胞有点变形飘起了什么原因

可能原因如下：1、可能是细胞贴壁不牢，活的死的细胞在PBS里面孵育，所以可能在作用后细胞漂浮起来，但漂浮的细胞可能是还是活细胞，如果还飘得话，可以参照悬浮细胞的操作，镜下看一下染色情况，看看飘的细胞是不是都是死细胞了。2、也有可能PBS的渗透压不合适导致细胞飘，我们使用的PBS渗透压大概在300左右。另建议配套试用试剂盒中的buffer组分，若使用PBS对于敏感细胞会容易出现飘或者细胞形态变圆情况等。3、也有可能是皿不合适，方便的话，也可以用爬片再试试。4、可能探针浓度太高了，在保证荧光染色效果的同时可以适当降低探针工作浓度.

贴壁细胞做流式怎么做?

经胰酶消化的贴壁细胞，可以类同步骤二、三的悬浮细胞染色操作。染色后的细胞悬液可直接上机检测。

可以固定吗？

这个试剂盒不能固定，要活细胞染色。

需要怎么设置波长？

流式可以选择FITC和PE通道。Calcein-AM Ex/Em：495nm/515nm；PI：535nm/617nm。

里面的试剂需要分装吗？

如果每次用量少，可以根据使用量分装避光保存，避免反复冻融。工作液需要现用现配。

细胞周期检测试剂盒（MA0334），细胞染色时间到了，但是来不及上流式怎么办？

可以先固定，加入 1ml PBS 充分重悬，成单细胞，轻轻边涡旋边缓慢滴加 3ml 预冷的无水乙醇，至 终浓度 75%，4℃固定 4h 以上，或者 4℃静置过夜（18-24h）效果更佳。固定后的细胞 可以-20℃保存一个月，之后检测时离心即可。

做细胞周期时，上清中的死细胞需要收集吗？

需要收集，处理后有一些细胞会漂浮，这部分都是阳性的细胞，如果没有收集，阳性细胞会比较少。

细胞周期检测试剂盒（MA0334），固定细胞时是细胞滴加在无水乙醇和乙醇滴加细胞区别大吗？

固定细胞一定用PBS重悬细胞后，再加入无水乙醇稀释到75%。不建议把细胞加在无水乙醇里。这样做是为了防止产生沉淀聚集的

细胞加了慢病毒，有绿色荧光，能用细胞周期检测试剂盒（MA0334）？

理论上可以的

细胞周期检测试剂盒（MA0334），流式检测的细胞周期结果怎么看？

从左到右，第一个峰是G1，第二个峰是G2，中间平平的是S期。G0/G1是G0和G1在总细胞的总占比，G1期DNA复制还没有开始，G0期是细胞静止期，不复制DNA，G0和G1从DNA含量上分不开，所以这两个和一起占DNA的总比例是 Dip G1。实验组跟正常细胞对照组对比，如果G1/S升高，就是阻滞在了G1/S检查点，导致细胞在进入S期之前在G1期积累。

细胞周期检测，不做固定这一步行吗？

不可以，PI染料是不具有膜透性的，需要固定后，PI才能通过细胞膜，进入细胞里结合到核的DNA上。另外在用流式细胞仪对细胞进行周期分析时，为了防止细胞的自溶和破坏，通常要对样品进行固定。

细胞会经过多聚甲醛和tritonX-100处理，但没有75%酒精固定，还能染细胞周期吗？

细胞经过多聚甲醛和tritonX-100处理可以继续做周期，按照固定之后那步接着做就行了，但是效果可能不太好，因为我们方法是我们摸索过的效果最佳的

细胞周期检测，在流式上样儿的时候，就是用FITC通道是吗？

FITC检测的是绿光，选488检测红光的通道检测，用PE或PI通道

细胞周期检测，这个胰酶对含不含edta和酚红有要求吗？种在6孔板里需要种多少细胞？

没有要求。接种数不做要求，按客户自行安排，检测每个样品细胞含量范围一般为10^5-10^6之间。

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒和AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒 这俩有啥区别 都是检测凋亡

MA0334是PI单染细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，从而进行细胞周期和细胞凋亡的分析。MA0334更侧重于周期检测，用他做的凋亡只是在流式检测时荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰，看不出凋亡分期。如果想侧重测凋亡的话，建议是推荐Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒等，可以区分出早凋、晚凋等，能够定量检测凋亡比例。

细胞周期检测，固定的时候能否直接加70-75%的乙醇重悬细胞固定？

不建议，如果直接用75%的乙醇，会导致固定效果差，效果没有说明书中的方案好。建议先用PBS重悬细胞后，再加入无水乙醇稀释到75%。

细胞周期检测，可以用荧光显微镜观察吗

荧光显微镜只是拍照荧光图片，分析不了周期情况了，做周期检测建议使用流式方法进行

细胞周期检测，细胞絮状沉淀很多，而且过滤不掉怎么办

因为固定操作后细胞就死了，染色工作液一定要现用现配，建议尝试室温孵育，孵育期间可以轻柔充分重悬开细胞沉淀，染色期间可以混匀几次，有助于染色。上机前吹散下，聚集情况会减少些，可以尝试看下

细胞周期检测，固定之后不能直接上机，我看说明书说固定-20没问题是么？那我具体怎么操作呢？PBS吸出？

不需要吸出，PBS和乙醇需要一直在里面放4度24-72h没问题，时间长的话需放-20，做的时候1000g 左右离心 3-5min，要沉淀细胞。

细胞周期检测试剂盒（MA0334），做凋亡和周期都是一样做的吗

操作是一样的，但MA0334更侧重于周期检测，用它做的凋亡只是在流式检测时荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰，不能区分出早凋、晚凋，定量各个时期凋亡比例。

细胞周期检测试剂盒（MA0334），没染色上或者不分群是什么原因

可能产生的原因及解决方法请参考：
1、细胞是否是出于能够分裂增值的时间：
①　细胞培养条件不对或营养不足，引起细胞生长缓慢，也会导致大量细胞进入G0期。此时需及时优化培养条件，否则时间一长会引起细胞状态变差，直至细胞死亡。
②　很多细胞生长密度过高，会出现接触抑制，同样会导致G2/M期缺失。当细胞产生接触抑制，就无法再增殖。因此，如果实验处理组是促进细胞生长，或导致G2/M期阻滞，有可能会出现完全检测不出来的情况，严重影响对实验结果的判断。所以，在进行细胞周期实验时，一定要保证检测时细胞尚有合理的生长空间。
因此可以选择不同融合度的细胞进行检测。
2、固定：
①　固定处理时建议细胞数为10^5-10^6之间，先加PBS重悬之后，再加无水乙醇，边加入边涡旋，直到乙醇浓度为75%，防止细胞固定的时候聚团，可以达到分散细胞更好的效果，由于细胞周期是检测单细胞的，因此细胞聚集会影响到细胞周期的检测结果。
②　细胞固定最后一步离心后，如果看不到细胞沉淀了，是正常的。这一步会有时候会看不到沉淀;默认已离到管底，正常小心吸就行,往后做染色就行，不需要调高离心力，以免导致细胞机械损伤。
③　固定后用pbs清洗，残留的乙醇可能会干扰测试时信号。
3、细胞收集、清洗时，不可过度吹打，以防有过多细胞碎片。
4、染色工作液现用现配，染色过程及染色后等待上机过程都需要严格避光。
5、染色完尽快检测是最好的，荧光会随着时间延长而减弱。
6、检测时可以取一个空白对照，经固定后，上流式用于调节电压，以便于对实验组进行分析。如果细胞进行了固定破膜处理，那么空白管也必须是固定破膜处理的细胞，因为细胞进过固定破膜处理后会缩水变小，和未处理细胞物理分布图不一样，一般情况下通过调节FSC和SSC电压，使细胞群体分布在坐标轴的中央部位，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外）。
7、目前看图片感觉细胞数量可能有一些少，周期建议用15000-20000事件数。
8、以免受到碎片的影响，阈值可以适当提高。
9、可以多制备一个或几个样本，染色后于荧光显微镜下观察，检测是否染上色了。

细胞周期检测试剂盒（MA0334），这个只有一个染料吗，不用设置单染吗

不需要设置单染调节补偿了，设置对照组和实验组即可，同时有的实验室需要单独准备一支不染色的细胞悬液先上机

做细胞周期检测，准备上机的时候发现有沉淀了，上机前是混浊的，上机后，机器测到的细胞非常少，拿出来一看，形成沉淀了怎么办

正常的，如果同时上样比较多，那需要一个个混匀，如果是自动进样的机器，那可以设置。

细胞周期检测里RNA A都要加吗

是的，加入进去配置成染色工作液

做细胞周期检测，这个1000g的离心速度，细胞会不会损坏 ?

一般按照说明书条件进行不会损伤的，主要是为了将细胞完全离心下来，如果客户想离心力小一些，那时间就需要适当延长一些，保证细胞收集下来

MA0334这个能测酵母细胞周期吗

不建议，酵母细胞有专用的检测试剂盒

做细胞周期检测，这款里面固定操作75%乙醇，可以更换为Triton x-100吗？

75%乙醇是固定的作用，Triton x-100是通透剂不是固定剂，不能替换。

做细胞周期检测，是否在细胞收集第三步加入预冷PBS后就可以拿出细胞间做了呢？

可以拿出去；后面操作不需要无菌，但是配置染料工作液还是建议在细胞间配，因为试剂盒里的试剂都是无菌配置的

Meilunbio®脂质体基因转染试剂这款，转染RNA可以吗

单独转染RNA可以，若是RNA和质粒共转染不太建议

Meilunbio®脂质体基因转染试剂使用后，转染不成功或转染效率低可能原因？

转染效果不好可能原因：
1、细胞状态不好：细胞状态不好，会导致转染效率低下。一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6×10^5个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。
2、质粒质量：转染用的质粒首先要保证数量，一般为2μg以上。质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，也会影响转染效率。这个时候，就应该对质粒进行纯化和浓缩。
3、做细胞转染的时候，在开展正式实验前做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。
4、转染试剂保存，转染试剂保存在4℃，不可冷冻；

转染过程可以加双抗吗？

不建议加的

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，能转染悬浮细胞么？

可以的，常见细胞类型的转染效率如官网表格

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，能转原代细胞么

我司主要验证多为常规细胞系，原代细胞理论上可以的，可能转染效率会稍低

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，稀释的稀释液是必须用说明书上的么，还是用其他的也可以？

推荐使用Opti-MEM培养基，有助于提高转染效率，如没有也可以用自己细胞对应的无血清培养基进行

转染实验对细胞密度有要求么？

转染前一天，用 500 µl 不含抗生素的培养基接种 0.5-2×10^5 细胞，使之第二天汇合度能达到 70-80%

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，不小心放在-20度了转染效果是不是降低了？

是的，这个产品是避免冷冻，转染试剂冷冻会影响脂质体的完整性与组成，会影响转染效果

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，质粒和转染试剂的混合有顺序要求吗？

可以将 DNA 稀释液慢慢滴加到转染试剂稀释液混合

转染过程中需要换液吗？

通常 DNA-转染试剂复合物和细胞一起孵育 6 小时已经足够产生较高的转染效率。大多数细胞在本产品转染后长达 72 小时未见明显细胞毒性。但转染后 6 小时更换新鲜培养基对于一些生长非常迅速的细胞有助于提高转染效率

Meilunbio®脂质体基因转染试剂能否用于构建稳转细胞株，效果与慢病毒转染有何区别

MA0672转染试剂可以用于筛选稳定细胞株,但一般用于稳转细胞株构建的前期将病毒质粒与供体质粒在转染试剂的帮助下转入293T细胞或其他研究细胞中，后续在收集病毒上清进行后续稳转细胞株筛选；如单独使用脂质体转染试剂做稳转细胞株，这个方法比较困难，而且获得的稳转细胞也很少，效果肯定不如慢病毒方法，所以不太建议单独用其进行。

使用转染试剂，转染完第二天能看到荧光，但是收集上清就看不到荧光了为什么

可能是病毒包装效果不好，低度太低了，可以做病毒浓缩处理下，保证滴度不低于1×10^8Tu/ml；另可能细胞密度过高或者过低，一般建议细胞密度40-50%。

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，转染293细胞挺好，转染成纤维细胞效果不太高为什么？

不同细胞转染效率不同，293细胞相比于成纤维细胞要好转染，转染效率高。建议可以看下这几个方面:1、细胞活性一定要良好，对数生长期。2、控制细胞生长密度，一般密度70％-90％左右比较好，尽量不要太高会影响转染效率。3、一般DNA-转染试剂复合物和细胞一起孵育6小时后更换新鲜培养基对于一些生长非常迅速的细胞有助于提高转染效率。4、可以调整下转染试剂和质粒的用量比例，提高转染效率

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，可以入核吗

有概率可能会入核，但比较少

Meilunbio®脂质体基因转染试剂，转染两三千bp的大片断，可以用吗

理论上可以的

可以用 FAM 荧光基团检测效率吗？

可以通过转染FAM或者GFP等荧光标记质粒，检测转染效率的

细胞转染48h后细胞都飘起了，转染试剂毒性大

建议转染前一定要选择状态良好对数生长期的细胞，同时可以提高些细胞接种密度，这样可以提高转染效率，也可减少细胞毒性。另建议可以使用optimem培养基作为稀释制备培养基进行，更有利于细胞状态和转染效率。如果细胞比较敏感，建议可以尝试转染6-8h后进行换液处理，一般孵育6h已经足够产生较高转染效率，也可以更好减轻细胞毒性影响

MA0219和MB4682有什么区别？

MB4682是ROS荧光探针，固体形式，需要自行配置成液体使用，配置后使用方法可以参考MA0219说明书。MA0219是我司的ROS检测试剂盒，里面包含了液体形式的ROS荧光探针，以及Ros up活性氧阳性对照，配套产品齐全，使用更加方便，如第一次进行ROS检测客户，建议选择MA0219。

MA0219试剂盒可以检测组织样本吗？

这款主要用于细胞检测。如需进行组织检测，需要将组织用适当的胶原酶或胰酶等消化处理成单细胞悬液，按照细胞样本进行检测，不能直接用于组织检测。

可以检测冷冻组织吗？

理论上是可以的，因为这个探针是检测酶的，冰冻组织酶还在，因此可以将冰冻组织制备成单细胞悬液后进行检测。

阳性对照加多少量？

加入的体积以能充分盖住细胞为宜，如对于 6 孔板通常不少于 1000 μL。

阳性对照的活性氧没有升高。

1、可能是细胞活性不好，探针进不去，探针孵育的时候将细胞消化下来试试，同时孵育时定时晃动体系，促进探针的结合。2、活性氧水平提高与药物孵育作用时间有一定关系，根据细胞类型会有比较明显差异。如HeLa 细胞孵育 30 min；MRC5 人胚胎成纤维细胞 1.5 h等，具体需要预实验测试看下。3、可以试一下提高Ros up的使用浓度，或延长阳性药物的孵育时间。4、若荧光强度低，也可适当增加探针浓度，如1:500或其他浓度；或是延长孵育时间，建议通过预实验确定最佳实验条件，探针装载的时间也可以根据情况在 15～60 min 内适当进行调整； 5. 阳性对照和探针可共孵育30min后再检测，无需分别孵育；6. 不建议加防淬灭封片剂，因为防淬灭封片剂容易导致细胞胀破；7. 建议探针孵育结束后，立即观察；

阳性对照是什么组分？

活性氧阳性对照 (Rosup, 50mg/ml) ；先用无血清培养基等 1:1000 稀释阳性对照（Rosup, 50mg/ml），加入细胞，一般 37℃避光孵育 20~30 min 可显著看到活性氧水平提高，具体组分不能提供。

药物是装载探针前加还是之后加？阳性对照呢？

对于刺激时间较短（通常为 2 小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为 6 小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。阳性对照一般刺激时间较短，可以跟探针一起共孵育。

需要固定吗？

不需要固定，活细胞进行染色。

荧光是什么颜色的？

MA0219是绿色荧光。

可以用酶标仪检测吗？

可以使用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜直接观察。488 nm激发波长，525 nm发射波长。

可以检测细胞内单线态氧吗？

体内正常代谢可以产生活性氧。活性氧族如超氧阴离子自由基（O2-·）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH·）和单线态氧都是有氧代谢的副产物。细胞内一般检测活性氧，也就是上述物质的总和。单线态氧是活性氧中的一种，此款试剂盒无法单独检测。

植物能用么？

不建议，这款主要用于细胞内。如果想试试可以用纤维素酶等处理去除细胞壁，变成原生质体细胞那种，建议预实验看看，我司暂时没有进行过植物检测的验证。

石蜡切片可以使用吗？

石蜡切片无法检测，石蜡切片经过固定，细胞都死亡了。冰冻切片理论上可以，冰冻组织酶还在，根据反应原理还可以进行检测，但是具体的操作方法和浓度还需进一步摸索

想额外进行细胞核染色，在哪一步进行？

最后进行细胞核染色，也就是在观察前进行。

ROS检测原上流式时可以用pbs重悬吗？

可以的，检测上机可以用生理盐水或者PBS进行重悬。

做流式细胞数量多少合适？

做流式，加入探针稀释液后，使细胞的密度在1.0×10^6~2.0×10^7/mL。阳性对照跟探针一起加入，孵育30分钟左右。

这个可以做细菌吗？

这款主要检测细胞方面的，细菌有细胞壁可能探针不太好进去，可以试试用溶菌酶等破细胞壁后再染色，建议先小试摸索条件。

多长时间内进行检测？

建议做完立即拍照，不要超过1小时。

SOSG怎么溶解？

用甲醇配成浓度约5mM的储液，即向每管100μg包装的小瓶里加入33µL甲醇。使用前立即准备本试剂的工作溶液，并在实验结束后丢弃任何多余的稀释试剂。

SOSG检测，荧光趋势不对，可能是什么原因？

操作注意事项：1)试剂配置母液分装冻存，避免反复冻融，荧光类产品随着配置后时间延长，荧光强度会减弱；2）试剂工作液要现用现配，避免工作液不稳定影响后续实验检测结果；3）不同ph溶液可能会有影响，在碱性pH条件下或者某些溶剂中会发生活化，而且随着时间的推移，其荧光产物在某些溶液中可能也会降解；4）工作也浓度可以适当调整，可能由于检测物浓度低，机器灵敏度不同等， 可以提高工作浓度，不是必须要按照下限1uM进行，我们给出的是范围，考虑有些客户使用的溶液本身可能会含有次氯酸钠、过氧化氢等激发物质。5）使用物质里是否有光敏剂，光敏剂与其作用可能会出现荧光峰值位移，荧光强度降低等情况。

SOSG检测，都可以用什么仪器检测？流式能用吗？

荧光检测仪器、荧光光谱仪或荧光酶标仪，不能使用流式进行检测。

SOSG检测，加样后多久内检测比较合适？

我司用水或者过氧化氢等检测是加完就测的，反应比较快。具体看药物作用时间情况，可以参考下文献或者测一下不同时间点的值看下最适合的点，比如设置0、2、5、10min等不同时间点对比看下荧光值选择。

SOSG检测，可以用DMSO溶解吗？

不建议用DMSO溶解。可能会影响，SOSG单线态氧荧光探针在碱性pH条件下或者某些溶剂中会发生活化，溶剂包括但不限于乙腈、DMSO、DMF、丙酮等。推荐使用甲醇进行溶解。

溶剂里有DMSO会影响吗？

可以做个溶剂组的对照，在做个单独水对照组对比看下，如果有影响可以扣去值。

酶标仪使用什么板子？

可以使用酶标板进行检测，如果实验室没有的话，用普通透明96孔板也可以的，如果用96孔板，可以组间间隔个孔进行，可以避免孔间干扰。

酶标仪测出的值显示over。

超过了仪器检测上限，可以降低增益设置。

可以做细胞检测吗？

SOSG这款不适合做细胞，是用于水环境检测的。检测细胞建议用活性氧试剂盒MA0219。

水中检测是活性氧的值也很高，可能是什么原因？

水中也有单线态氧，实验组如果产品单线态氧比较多，荧光强度会更强。另注意：光敏剂某些会影响最大检测波长，或者可能会由于能量迁移等影响荧光强度。

工作液怎么配置？

可以直接将甲醇溶解后的母液，按照比例直接加入待测溶液中。

检测波长怎么设置？

Ex/Em:504/525nm。

说明书说是蓝色荧光，加了甲醇之后溶液是橘色的。

蓝色是荧光颜色，这款粉末是橘色，配置后液体是橘色的。

配置后怎么储存？

母液可以置于-20℃或者-80℃避光保存，一般1-3个月。工作液建议现用现配，工作液当天使用可以4度保存，母液建议分装，避免反复冻融。

可以用在动物体内吗？

这款主要检测水溶液中单线态氧，不可以用在动物体内。

细胞二价铁离子（Fe2+）荧光法检测试剂盒可以与DAPI一起染色吗?

铁离子这个适用于活细胞内Fe²⁺的检测，而且染色后不建议换液和固定处理，所以可能不太适合与DAPI一起共染色。如果想尝试染色细胞核，建议使用Hoechst 染料，同时共染色或先染铁离子再染核，预实验先小试看下效果。

细胞二价铁离子（Fe2+）荧光法检测试剂盒这个可以做流式吗？

理论上是可以的，探针与细胞内亚铁离子结合呈现橙红色荧光（Ex/Em=543/580 nm），根据流式仪选择适合这个波长的通道，比如PE通道。实验方法按照悬浮细胞进行，如使用贴壁细胞，需要先用胰酶消化收集，之后按照说明书悬浮细胞方法进行染色。

细胞二价铁离子（Fe2+）荧光法检测试剂盒中阴性和阳性试剂分别加多少？

阳性处理组用硫酸二价铁铵(II)（终浓度200 μM）37℃孵育30 min，随后用PBS洗涤，然后在阳性处理组和阴性处理组（2,2-联吡啶，终浓度200 μM）的细胞中分别加入细胞二价铁离子（Fe2+）荧光法检测工作液，37℃孵育30 min。孵育结束后，不洗涤，直接置于荧光显微镜下激发成像。阳性处理可以跟药物孵育的时候一起加入到细胞内，阴性处理跟探针一起加入到细胞内即可。

染色定位在哪里？

荧光染色位置主要在胞质内。

可以固定吗？

不建议染色后固定处理和更换清洗液，这些处理会导致探针泄漏到细胞外影响荧光强度效果。

进行荧光检测对酶标板有要求吗？

需要不透光的黑色酶标板。

10T是可以用多少次？

以 96 孔板为例，MA0647-1 可检测 10 个孔的样品；MA0647-2可检测96 个孔的样品。因不同细胞最佳工作浓度不同，试剂盒里给的组分量都是多于10T的。

可以用于组织检测吗？

只适用于活细胞内Fe²⁺的检测 组织需要将其制备成单细胞悬液再按照悬浮细胞的方法进行染色。

XX细胞推荐探针浓度是多少？

实验室平时常用Hela/Vero/T47D等几种细胞系，一般常用探针终浓度均为1 μM，都可以成功染色，这几种中同浓度下相比HELA细胞染色效果荧光最好，所以不同细胞种类、细胞浓度的染色最佳条件也不同。对于XX细胞，如首次实验，可以尝试用终浓度1 μM进行孵育染色，如染色亮度低等可以再适当提高染料浓度，可在探针的工作浓度为 1-5 µM调整。

多久之内进行检测？

建议尽快检测，尽量1h内，荧光随着时间延长而逐渐衰减。

为什么我拍的亚铁离子荧光很红，与说明书颜色不符？

激发波长：540-550 nm，发射波长：570-580 nm。不同显微镜的滤光片波段不太一样，宽窄不一样，所以可能会有一点颜色偏差，属于正常的情况。正常使用绿色滤光片，观察到的是橙红色的荧光。

里面缓冲液可以用什么替代？

染色的时候必须用染色缓冲液 ，如产品剩余的不太够，清洗的时候可以用PBS或是hanks这类缓冲液替代 。

可以测溶液吗？

不适合，这款主要检测细胞内二价铁离子的。

可以测植物吗？

植物细胞有细胞壁探针不好进入。也可以试试先用果胶酶等处理破除植物的细胞壁，再进行检测。

可以检测细菌吗？

不太推荐，这款主要用于细胞方面的，细菌有细胞壁透过性效果应该不太好。

探针孵育结束之后，不需要弃掉探针液体然后润洗一下吗？不润洗的话会不会存在假阳性的问题呢？

更换培养基会导致探针泄漏到细胞外，因此染色后不要更换培养基，直接检测。

细胞染色缓冲液+探针溶液配制成的工作液，能4℃保存1~2周吗？

不行，工作液现用现配。经过实测，配置好的工作液存放后荧光会下降很多。

共染核怎么操作？

在上机检测/观察前加入hoechst进行细胞核染色。

贴壁细胞也是用这个步骤吗？

说明书是以悬浮细胞举例进行的，清洗后需要重悬在进行检测，贴壁细胞正常染色清洗就可以，就不需要重悬了，清洗完3次，再加hepes，孵育检测就可以了。

钙离子探针染色，发现染不上。

可使用Pluronic F-127，可以防止Fluo 4-AM在缓冲液里聚合并能促进其进入细胞，达到更好的染色效果； 2. 加入丙磺舒（阳离子转运体抑制剂），降低探针进入细胞后被外排的几率，来改善信号低的问题；3. 提高染料浓度，使用3 µM 的Fluo-4 AM工作液加入细胞（染液量需足够覆盖住细胞），37℃孵育30min后，无需弃掉染液，加入含有1%胎牛血清的HBSS，继续培养40min后；4. 染色操作的全过程要求做好避光操作，防止探针淬灭；5.染色结束后需尽快拍摄，荧光的衰减会随时间延长而越来越弱； 6. 染色工作液现用现配。

5倍体积是怎么加，6孔板也放不下？

5倍体积的HBSS如果加不进去，加2-3倍体积也是可以的，或者也可以减少些工作液体积，保证完全覆盖住细胞层。

HBSS有推荐吗？

MA0041或者PWL054这两款HBSS均可。

Fluo-4 AM需要加入DMSO进行配置吗？

不用，本 Fluo-4 AM是配制于无水 DMSO（anhydrous DMSO）中的储存母液，浓度为 2mM，储备液形式提供的，可根据需求分装使用。

Pluronic F127必须加吗？怎么加？

Pluronic F127可以选择添加，非必须，添加会有助于染色效果。Pluronic F127可以直接加到母液里，但是母液总体积比较小，加入后可能不好溶解，也可以加到工作里，保证终浓度是0.02%-0.04%。

可以用荧光显微镜观察吗？

可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪进行检测。

胎牛血清的作用是什么？必须要加吗？

血清的作用是防止探针外泄。加的话染色效果会好一些。也可以不加，看看染色效果能不能达到要求。建议最好按照说明书的方法操作。胎牛血清使用细胞培养过程中使用的FBS即可。

可以固定吗？

不建议固定，建议活细胞进行染色后尽快检测观察。

HBSS溶液是含钙镁的吗？

都可以，对钙镁离子没有要求。

可以用PBS替代HBSS吗？

HBSS和HEPES可以替换成PBS，但是效果会有所下降。

MA0194和MA0196哪个用得多？怎么选择？

MA0196用的可能会多些。可以根据仪器的检测波长进行选择，Fura-2 AM(钙离子荧光探针) Ex/Em 369/478 nm ，Fluo-4 AM(钙离子荧光探针) Ex/Em 494/516 nm 。

有可以做活体的细胞膜染料吗？

推荐MB12482，所发射的红外光可以高效地穿过细胞和组织。使用活体成像仪进行拍照，Em/Ex=740/850nm。

为什么DMSO母液有光，但是用PBS稀释就没有光了？

正常的，水溶液稀释环境，直接测试DIR荧光很弱，只有当细胞膜结合后，荧光信号才会大幅度提高，这是该染料的特征之一。

dir染料用于小动物活体成像有浓度推荐吗？

DIR染料的生物分布、代谢和毒性可能因动物种类和个体差异以及给药方式而异，因此确定最佳剂量通常需要通过预实验来优化，起始剂量可参考相关文献中的浓度做为预实验的参考浓度。

怎么溶解？溶解完是什么颜色？工作液怎么配置，需要现用现配吗？

Dir固体是蓝色的，使用DMSO或乙醇配置浓度为1-5mM的母液，配置完溶液颜色为深蓝色。溶解后分装储存，保存在-20 ℃，避免反复冻融。工作液需要现用现配，使用合适的缓冲液(如：无血清培养基，HBSS或PBS稀释成需要的工作液浓度，常用的浓度为1～5 µM。工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找最佳条件。

可以用于外泌体染色吗？

可以的 它是一种亲脂性荧光染料，通常用于标记细胞膜和追踪细胞内的某些结构，包括外泌体。

JC-1试剂盒，染色缓冲液用PBS替代可以吗？

不建议，这个组分是经过优化的，有利于染色液的配置溶解和染色效果。如果想自配可以试试含0.02% Pluronic F-127的Hanks，但可能没有试剂盒中带的缓冲液好。

JC-1试剂盒，组织样本能测吗？

组织可以检测，但是组织需要做成单细胞悬液，然后按照悬浮细胞做。注意需要新鲜组织，冻存的组织不行。

JC-1染色后，染色有噪点。

探针没溶解完全会有噪点，一般这个探针特点是有可能会凝固而粘在离心管管底，可以如下操作：试剂盒-20取出之后，JC-1(200X)探针在25℃水浴5-10min左右看完全溶解之后，一点沉淀看不到，小白点也没有的情况下，在进行配置，然后JC-1染色缓冲液(5X)使用37度水浴5-10min之后再用。另外探针最后配到缓冲液里之后如果有超声仪带加热的话放到超声仪里面37度5min，拿出来在加到细胞里面，如果有超声仪没有加热功能就超声8-10min左右，如果没有超声仪就37度水浴10min左右。

JC-1试剂盒，流式检测贴壁细胞怎么操作？

先消化收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法操作。

JC-1试剂盒，细胞不耐受试剂盒中带缓冲液，孵育后细胞飘，怎么解决？

有一些细胞类型需要营养成分比较高，且比较敏感，可以尝试用不含酚红的无血清培养基稀释配置，配置后注意下是否有析出等，JC-1母液的水溶性不好，可以37℃超声处理助溶，一定要充分溶解完全后再用。

JC-1和JC-10有什么差别吗？

jc1和jc10都是检测线粒体膜电位的，jc1是用的最多的，jc10溶解性更好。我司目前的JC系列探针中，MA0338 JC-1是试剂盒形式，包括了阳性对照、探针以及缓冲液。MB6097 JC-10是溶液形式的探针，其他试剂需要自己准备。可以根据需要自行选择。

孵育可以在37℃恒温箱进行吗

可以的。

阳性组染色都比较模糊，荧光弱，也未见膜电位降低情况。

1、JC-1(200X)探针和JC-1染色缓冲液(5X) 在25℃水浴5-10min左右看完全溶解之后，一点沉淀看不到的情况下在进行配置，另外探针最后配到缓冲液里之后如果有超声仪带加热的话放到超声仪里面37℃5min，在加到细胞里面，这个试剂一定要充分溶解混匀再用避免影响染色效果。2、因不同细胞类型，最佳CCCP 的作用浓度和作用时间可能会有所不同，建议可以尝试阳性组按照1：100比例稀释后作用细胞30min左右，随后装载探针孵育，再进行膜电位的检测观察看下结果。

可以用什么仪器检测？酶标仪可以吗？

可以使用荧光显微镜，激光共聚焦显微镜，流式细胞仪或者酶标仪。其中酶标仪分析Red／Green平均荧光度值，如果比值变小就是膜电位降低了。

可以做植物吗？

测植物线粒体需要将新鲜组织提取线粒体，然后进行纯化线粒体的检测。

怎么保存？

在-20保存。JC-1(200X)需避光保存，并尽量避免反复冻融。超纯水和JC-1染色缓冲液(5X)可4度保存。

检测怎么设置激发和发射？

检测 JC-1 单体时可以把激发光设置为 490nm，发射光设置为 530nm；检测 JC-1 聚合物时，可以把激发光设置为 525nm，发射光设置为 590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。
如使用荧光显微镜观察，检测 JC-1 单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察 GFP 或 FITC 时的设置；检测 JC-1 聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或 Cy3 时的设置。

一个视野里又能观察到红色又有绿色，是什么问题？

红绿色重合了，是由于串色了。因为这些染料都有很宽的吸收和发射光谱，光谱之间有明显的重叠。因此，激发荧光素的氩离子激光器的488nm 也能激发PI，尽管激发程度较低。荧光显微镜观察肯定会串色的。流式可以画门区分。荧光显微镜解决不了，除非会图像处理，减去串色。

MA0338里的阳性对照没有了，可以用什么来替代

可以选用美仑的货号MB2524 CCCP产品，进行溶解配制后使用

流式处理如果膜电位下降怎么变化？

线粒体膜电位较高时，JC-1以聚合物(J-aggregates)形式存在于线粒体基质中，产生红色荧光。线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体中，而是以单体(monomer)形式弥散在整个细胞中，产生绿色荧光，故此通常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例；JC-1单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。FITC－A通道是绿荧光，PE－A通道是红荧光，看Red／Green平均荧光度值，如果比值变小就是膜电位降低了。

可以固定吗？

我司三款溶酶体探针，都不建议进行固定，溶酶体基本都是染活细胞的，由于溶酶体探针pH依赖比较强，固定后会破坏溶酶体的酸性环境从而会造成荧光减弱甚至消失的情况，染色前后均不建议固定。如必须要进行固定，可以尝试使用MB6042，染色后固定效果要稍好于MB6041。

荧光是什么颜色的？

MB6041为红色；MB6042及MB6043为绿色。

需要加多少工作液？

根据使用的培养板大小，完全覆盖住细胞即可。

溶酶体探针使用后染色很浅。

1.含探针工作液一定要37℃预热，不然有影响。2.浓度和孵育时间可以调整，适当延长。

染色后需要润洗吗？

不需要。

一次使用不了，可以稀释成100um在分装么？

本品以溶于无水DMSO的1 mM储存液形式提供;更推荐分装产品原液形式，稀释后再冻存产品的稳定性没有原液好，避免影响效果，另工作液一定要现用现配

使用什么稀释成工作液？

建议使用无血清培养基稀释，尤其是在长时间染色的实验中，培养基里提供的营养成分比PBS全面，能保持细胞更好的状态。

这两款探针有什么区别？

这两款都是线粒体荧光探针，MB6046染料的积累取决于膜电位的高低，为红色荧光，可以固定、通透；MB6044不受膜电位影响，为绿色荧光，只能进行活细胞染色，不可以固定通透，固定之后，会导致荧光信号丢失。

细胞用胰酶消化传代会对荧光有影响吗？或者贴壁细胞先消化，然后按照憙浮细胞的染色方法染色之后再铺板可以吗？

没有影响，可以先消化再染色，染色后当天检测，荧光会随着时间的延长而逐渐减弱。

MB6044染色工作液怎么配置？

使用细胞培养级别的无水 DMSO 将其充分溶解至终浓度1mM。即50 µg 粉末需加入 74.4µL DMSO 即可得到1 mM储存液。工作液需要现用现配，使用适当的缓冲液或者细胞培养基稀释 1 mM 储存液至工作液浓度。本探针工作液的推荐浓度为 20-200 nM。

请问想用这个产品使用荧光显微镜拍照活死菌，该怎么操作

也可以，如用荧光显微镜，可以适当提高染料加入剂量，可以预实验摸索下，数据处理注意用merge方法区分活死细菌。具体操作也是按照说明书进行的，做显微镜可以不用加微球了。用荧光显微镜的话选择其仪器观察红色荧光和绿色荧光对应的滤光片进行检测

请问试剂盒里面的微球是什么作用？

微球是计数的，样本中的细菌密度可以通过细菌信号和微球信号的比值确定

细菌活死染色试剂盒，绿色荧光染料meilungreen和红色荧光染料PI（碘化丙啶）分别选多少的激光、多少的通道？

用FITC和PE通道

活死细菌试剂盒，颜色变化肉眼可见吗？

是荧光检测原理的，需要用流式检测或者荧光显微镜检测观察

大肠杆菌，可以用这个活死细菌染色试剂盒么

可以，本试剂盒适用菌种广泛，主要包括：蜡样芽胞杆菌、枯草杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、黄体微球菌、草分枝杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、沙雷菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌等。

可以染细菌生物膜吗?

生物膜，有特定染料，这个不行

嗜酸性细菌能不能用 ？

可以的

不用流式可以直接计数吗？

不能，这个是通过标准微球精准测量样品体积，计数得用流式

荧光显微镜检测拍不到荧光什么原因？

（1）于显微观察时候，可以适当提高加入剂量促进染色。
（2）步骤 1.5 的清洗步骤通常可以有效的去除菌悬液中干扰染色的成分，在清洗步骤中不推荐使用磷酸盐，因其可能会降低染色效率。

这个可以用共聚焦检测吗？

可以的

需要固定吗

因为染料是通过细菌膜的完整性进行染色的，不能固定，如果固定后细菌都会染上红色荧光

这两种染料的激发和发射波长

meilungreen：485⁄498、PI：535⁄617

这里加入的是10ulOD值＝1，还是OD值=1的1ul，稀释十倍再加入

指的加入的10ul OD值＝1，如果菌悬液非常浑浊或 OD600 检测值大于 1，可以对其进行稀释后再加样，以便得到更准确的检测结果；

微球的粒径是多少？染色后还能继续培养吗？

微球位置大概在10^6左右。一般不会继续培养了，虽然理论上说，这个染料对细菌都没有明显的毒性，但是状态不能保证了。咱们一般上流式的用量也不会特别多，建议还是取一部分染色然后上流式，剩余的没有染色的继续培养这样。

显微镜拍摄前是否需要洗去多余染料？还是说不洗也行，通过调整曝光把背景调暗细菌亮色

可以不用清洗的

内参过曝

大连美仑ECL是飞克级/低飞克级的，灵敏度比较高，内参蛋白的话，建议使用的时候，如果能调节时间的话，尽量时间短一些，如果手动曝光的话就1-2s就可以，一抗洗膜时间和洗膜次数可以适当延长。或者可以适当增加抗体的稀释倍数。另外如果想稀释ECL使用，可以用水，稀释4倍(稀释B液，不能稀释A液)试试

曝光磷酸化蛋白比较模糊

可能原因：1）因为磷酸化蛋白本身含量就少，特异性再不好，很容易出现这样的条带，抗体一定要买好一点的；
2）目的蛋白如果较大，转膜时间要延长，适当调整转膜时间；
3）适当调高一抗二抗稀释倍数；
4）磷酸化封闭用tris体系的BSA，封闭时间可以长一点。

曝光后背景高

可能原因
1) 封闭时间不够，5%脱脂奶粉一般建议封闭时间为1-2h
2) 一抗浓度过高，建议根据抗体说明书上稀释范围，适当提高稀释比例，降低抗体浓度，或者适当缩短二抗孵育时间
3) 洗膜时间或次数不够，建议延长洗膜时间或增加洗膜次数
4）曝光过度，建议适当缩短曝光时间，若缩短曝光时间无条带，可能为抗体浓度过高。

只能曝光1min，再曝光就不显色了

可能是操作过程中有什么污染了，比如保鲜膜，枪头等。建议采用将显影液滴加在膜上的方式使用 避免枪头混用 注意：不要将配好的显影液先显一张膜，再继续泡下一张显影，这样相当于回收再利用了，HRP反应完就不够下一张膜反应了

ECL曝光一片空白，怎么验证是不是ECL问题？

ECL发光液是由发光底物鲁米诺和过氧化物反应发光，所以如果存在HRP酶，就可以催化过氧化物并引起鲁米诺的发光。
可以分别吸取200ulA和B液，在1.5ml离心管混匀。再取1ul二抗，用纯水稀释1万倍，混匀后，吸取1ul加入到加有AB液的1.5ml离心管，然后把离心管放到化学发光检测仪器里面检测，或在黑暗处也可以肉眼观察看是否有光，如果没有光，说明ECL失效了。
另外配制的A/B混合工作液，溶液颜色应该是淡粉色，如果是发黄和变浑浊，表明产品已经失效。

放-20度了 ，会不会有影响呀

解冻后看是否有析出，如有析出可以尝试25-30℃试试，如没有析出问题不大，可以小试看下效果

把膜烧了一样 就是条带直接在明场里就显出来了

这个是因为ECL试剂过量、或是过于灵敏 蛋白含量/丰度 太高 导致的反应过于强烈 因此在常光下也能看到反应 可以降低蛋白浓度、提高些抗体稀释倍数 或者是减少ECL的用量。如果要稀释的话，建议稀释比例：B液用去离子水稀释4倍，然后再跟A液1:1混合使用

可以稀释用吗

可以的，如果感觉灵敏度高可以稀释用，可以用去离子水进行，稀释4倍(稀释B液，不能稀释A液)

条带有点泛白,背景很糊，看不清条带

ECL使用时看下避免不小心枪头倒吸污染影响灵敏度降低，或者ECL配置后尽量现用现配，不用室温放置过长时间，另尽量不要用不同的膜反复浸泡在同一盒ECL液进行显影，这样后面反应的条带可能灵敏度就降低影响显色效果

成分含义银离子等吗，可以排到下水道吗直接

不含的，可以

MA0186 配好后保存多久？

ECL工作液最好在临近使用前配制，发光强度会随时间缓慢减弱，建议在两小时内完成实验。

曝出来的膜背景深，Maker条带白斑。考虑可能是二抗浓度高的原因，想咨询这款显影液是否存在需要对应调低二抗浓度的问题

降低抗体浓度，一抗二抗清洗的时候也可以增加一些清洗的时间 曝光时间可以缩短一些 封闭时间可以适当延长 可以按照这几条建议 逐条排查一下

MA0186和MA0187什么区别,有啥推荐技巧

MA0187相比MA0186灵敏度更高，亮度更好。
首次购买我司ECL或是购买过我司预制胶等产品的客户，优先推荐MA0187，因为亮高更容易抓住客户。
使用过MA0186的客户，可以推荐其使用灵敏性更高的MA0187；
1.如果客户买的很多，曝光效果也足够好，可以不强推MA0187，但是可以告诉客户我们有MA0187，灵敏性更高，可以试试；
2.之前用MA0186可能有个别时候说过某些不太好曝光出的蛋白曝光不是很好，这个时候就一定推荐MA0187；
3.如果客户说用MA0186都过曝，那就尽量不推荐MA0187。
4.抗体药制备的工业客户，这种客户一般都曝光不是很常见蛋白，或者自己纯化蛋白，浓度较低，这个时候MA0187最合适。

ECL发光液能用于伯乐的凝胶成像仪吗

化学发光仪可以的
有的凝胶成像仪是做EB，SYBR Safe, SYBR Gold 和 SYBR Green这种的，可以分析可见光和紫外光的成像，对于western blot化学发光达不到(是否能够拍摄到ECL的图像主要取决于设备是不是带有冷CCD.只有制冷的CCD才够灵敏度捕捉到膜上发出的光)

咱们这个灵敏度能达到多少飞克

这个不好评估，也要看二抗酶的活性，暂时没有具体定量的值

ECL滴到伯乐玻璃板上了，现在蹭不掉了，这个东西得用什么能清除掉？

用水泡20Min左右，然后用抹布或纸巾擦下试试

条带应该一致，但是每次都有趋势的减弱

洗完后，多甩甩，把膜表面弄干一点，有时候膜表面有液体，影响结合（滤纸吸一下等）；然后洗膜的换成PBS或者TBS最好；AB液混合后要尽快用完，现配现用，其效果会随着时间延长而慢慢降低；AB液混合后颜色看下有没有异常，避免污染

pvdf膜的发光液 能用咱MA0186吗

可以的

能不能检测到5kd以内的多肽

ecl曝光这个和分子量没有关系，只要在膜上，这个试剂原理只要是二抗带HRP，蛋白在膜上，就能让他发光，所以蛋白多大没关系，飞克级别只是产品的灵敏度，就是识别蛋白的含量，因为不同蛋白含量不一样，所以会出现有的过曝，有的曝出阿里很浅，但是和目的蛋白大小没关系,

ECL工作液使用中很容易失效，是什么原因

原因和优化操作建议： （1）ECL 通常分为 “ A 液” 和 “ B 液”，需现配现混。若提前混合（如提前 1 小时），随着放置时间延长其发光强度和灵敏度会下降；（2）操作过程中避免引入杂质污染，ECL 反应体系对 “金属离子、还原性物质、蛋白酶” 等杂质较敏感，这些杂质会干扰反应影响产品效果；（3）建议每张膜单独滴加使用新鲜的 ECL 工作液，避免将不同的膜反复浸泡在同一盒 ECL工作液中，因为膜上的 HRP会持续催化 ECL 的反应，每浸泡一次就消耗一部分底物，发光信号会显著衰减；（注意：不要将配好的显影液先显一张膜，再继续泡下一张显影，这样相当于回收再利用了）

显影液配置完是暗红色的。配置完发黄。

正常配置完是几乎无色透明的。首先检查一下原瓶中的AB液颜色是否有异常，正常为无色透明澄清液体。配置后颜色变化可能是由于pH或者离子反应影响，多数情况是配置的时候带入了外源污染物质导致的。可以更换新的配置容器、枪头，AB液不能混匀枪头，重新配置。

配好后保存多久？

ECL工作液最好在临近使用前配制，发光强度会随时间缓慢减弱，建议在两小时内完成实验。我司实际检测过配置后6小时再进行曝光实验，依然是好用的。

室温放了几天有影响吗？

我司稳定性测试结果供参考，37度放置一周，使用没有问题，但是各个实验室温度变化等无法确定，建议先进行小试，没有问题再正常使用，尽快放入4℃保存。

AB液分别是什么颜色的？

无色透明澄清液体。

蛋白没有显出来。

可能与一下情况有关：1、抗体浓度低。2、转膜不成功。3、蛋白降解或蛋白丰度较低。4、ECL没有完全混匀。

淋在膜上使用的，曝光时间长。

如出现ECL显影时间较长可能考虑以下几个方面：1、滴加显影液前尽量吸净上面残留的洗涤液再滴加；2、滴加ECL在膜上要均匀扩散；3、抗体的稀释倍数过高，导致不好识别；4、某些特别不好出的蛋白，对应需要的曝光时间辉有点长；5、显影液有没有冻存过等影响，导致AB中有成分析出影响；6、或者显影液过期，灵敏度降低等

MA0187试剂盒的检测最低限

可检测低飞克级抗原。特别适用于丰度较低或痕量目的蛋白的检测

RNA pull down 的蛋白酶抑制剂可以用吗

可以的

这个跟 MA0151是按什么比例加的

按照 1：100 的比率(体积比体积)将抑制剂混合物加入到细胞裂解液。含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存待后续使用。

在冰上放了一天没化开

因为溶剂是DMSO，DMSO的凝固点大约在18度左右，在4度会结冰冻住，可以室温或者常温水浴助溶，溶解后就尽快分装取用，其热稳定不好，避免影响效果。建议客户分装冻存，体积小更容易溶解。

已经溶解的Cocktail为什么还要用DMSO溶解

试剂盒里面是蛋白酶抑制剂溶解在DMSO溶剂里面的，不需要再用DMSO溶解，用之前用裂解液或者其他试剂稀释100倍就可以了

有活性么？

没有活性，这个产品是蛋白酶抑制剂混合物，一共6个混合物，对应6个靶点，从而保证蛋白完整性

MB2678是否包含了磷酸酶抑制剂剂？

MB2678不包含磷酸酶抑制剂，如做磷酸化蛋白，需要同时加入与MB12707联用

可以做植物的原核细胞的表达嘛？

应该是用于表达后的这个蛋白提取过程吧，这个应该可以的，但是溶液中含有DMSO，请客户看一下DMSO是否会影响实验，再决定是否使用。

Mb2678是所有标签都适用嘛，还是说对于his 的更好

这个是蛋白酶抑制剂，不影响标签蛋白的表达

这款成分中含有PMSF么？

不含，但是有替代PMSF的同类产品了；用这个不用加pmsf了，不过客户想加也可以加

做IP,配了裂解液，加入了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，然后转珠子，收得时候液体变黄了，刚加的是透明的，裂解后收集变黄了

这个变黄的有两种可能。1、裂解过程一般需要再冰上进行的，如果裂解时间较长，且在室温进行，酶可能会失活导致酶颜色变黄；2、裂解时间长，核酸出来了，核酸也会导致颜色变黄。

蛋白酶抑制剂能和别人家的磷酸酶抑制剂混合用吗

可以

这个蛋白酶抑制剂可以用于后期做Elisa吗

每家elisa 试剂盒对样本前处理的要求不太一样，可以看下对应ELISA说明书是否需要用蛋白酶抑制剂

我们的蛋白酶是EDTA-free么

是的，不含EDTA；

是否可以用于植物蛋白

可以

细菌提取蛋白可以使用抑制剂混合物这种吗

可以的

要加EDTA的话，有推荐的浓度么？

当与磷酸酶抑制剂混合物连用时，建议不加 EDTA，因为 EDTA 会严重影响磷酸酶抑制剂混合物中某些成分的抑制效果。如果实验需要添加，可使用0.5M的EDTA。本蛋白酶抑制剂混合物为100X的储存液，使用时按照1:100的比例加入到裂解液中(例如，1ml裂解液中加入10μl蛋白酶抑制剂混合物)，混匀后即可使用。含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存待后续使用。根据需要，0.5M的EDTA也按照1:100的比例加入到裂解液中。

MB2678蛋白酶抑制剂混合物和100mm PMSF有区别吗？

PMSF抑制丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。还可抑制半胱氨酸蛋白酶（可通过还原的硫醇可逆）和哺乳动物乙酰胆碱酯酶，范围比较小。MB2678混合物含有AEBSF丝氨酸蛋白酶、Aprotinin胰蛋白酶抑制剂、Bestatin氨肽酶的金属蛋白酶抑制剂、E-64半胱氨酸肽酶抑制剂、Leupeptin亮抑酶、Pepstatin A天冬氨酸蛋白酶抑制剂，更加全面。因此与PMSF相比，蛋白酶抑制剂混合物不但保护更加全面，而且效果更加持久。

这里面有磷酸酶抑制剂么？能跑磷酸化蛋白么

没有，如需要磷酸酶抑制剂可以使用MB12107。因此磷酸化蛋白需要用MB2678+MB12707。

客户如果购买mb2678还用购买mb12707么？

如果客户有磷酸化蛋白要跑，就需要买，如果没有就不需要了。

和罗氏Cocktail有什么区别吗？

可以用MB2678替代。

磷酸酶抑制剂加进去后裂解细胞有的白色，有的土黄色。

这个变黄的有两种可能。1、裂解过程一般需要再冰上进行的，如果裂解时间较长，且在室温进行，酶可能会失活导致酶颜色变黄；2、裂解时间长，核酸出来了，核酸也会导致颜色变黄。

冻存后产品颜色变黄了

成品冻完就是有点淡黄色，里面有原钒酸钠，可以正常用。

可以用于植物吗？

可以。

只是防止去磷酸化状态，还是说它还能防止蛋白质的降解呢？

蛋白磷酸酶抑制剂，只能达到维持蛋白磷酸化修饰的作用，如果需要防止蛋白降解，维持结构完整性，那还需要加蛋白酶抑制剂。

加了loading之后变绿。

应该是loading buffer里的溴酚蓝变色了，一般酸性环境变黄，碱性变紫，所以可能是ph改变导致的。考虑应该是loading和这个蛋白酶抑制剂不适配，不能一起用。

预制胶跑不下去

建议查看是否是由于胶条没撕引起的。底部胶条不撕掉，会导致电流不通，无法电泳。需要将蛋白预制胶从包装袋中取出撕掉胶板底部的蓝色胶带，缓慢地拔出梳子，将预制胶固定在电泳槽中。

预制胶有浓缩胶么？

预制胶有浓缩胶，浓缩胶的浓度为5%。

预制胶可以储存在-20℃吗？

不可以，预制胶需要4℃保存。-20℃保存会导致胶被冻裂，无法正常电泳。因此不可至于-20保存液，也不要放置在4℃冰箱的冰箱壁周围或出风口处，这些位置的温度都更低，也可能会导致胶被冻裂。在使用前，请观察预制胶，没有裂痕，则可正常使用。

预制胶需要使用什么电泳缓冲液？

不同体系的预制胶需要使用对应的缓冲液，如Bis-Tris（MOPS）体系的预制胶需要Bis-Tris电泳缓冲液。而tris-Gly体系预制胶则需要使用甘氨酸体系的缓冲液。

使用伯乐的电泳槽，漏液。

Bio-Rad 电泳槽使用时将框架内绿色硅胶密封条取出，然后将其平坦的一面朝外并重新装回凹槽中。电泳槽内槽加满电泳液，外槽的电泳液加到 1/3 液面处即可，最高不可漫过胶板。如未将密封胶条反装则会引起漏液，导致电流异常，无法正常电泳。

预制胶跑的特别慢。电流特别小，已经撕掉胶条了，跑不下去。

请检查缓冲液体系是否配套，如果预制胶是MOPS体系，则需要使用MOPS体系的缓冲液，如使用甘氨酸体系缓冲液，则会造成电泳结果异常。

条带波浪形。

1.电压过高：如果电泳电压设置过高，蛋白质分子在凝胶中迁移速度过快，可能会导致条带出现波浪形。2.电泳时间过长，电压过低，蛋白质可能会在凝胶中过度扩散，影响条带的形状，建议设置150V，电泳1小时左右。3.上样量过大：上样量过大时，蛋白质分子在泳道中过于拥挤，会相互干扰迁移，可能使条带呈现W型。4.样品变性不充分：如果 loading buffer 失效或样品煮沸时间不够，蛋白质可能没有完全变性，会以不同的聚合状态存在，在凝胶中迁移时表现出异常的条带形状。可降低上样量。5.电泳液过于陈旧或配制有问题，如缓冲液成分比例不正确、pH 值不准确等，会影响蛋白质的带电性质和迁移率，导致条带变形。可更换相同体系且新配置的电泳。

拔胶的时候梳齿断了。

建议拔梳子的时候，两边一起水平缓慢的拔。另外这个梳齿比较紧，要在装电泳槽之前拔梳子，跟手灌胶不一样，不能装在电泳槽里拔，用不上力气。

电压多少？

最高可以160V恒压，也可以恒压120v, 或者先80V压一压，再转120V跑也可以。150-160v，50-60分钟跑完。

使用梯度胶，小蛋白的位置marker会变小，蛋白也会不清晰。

梯度胶下边浓度大，1.如果电泳时间过长横向分散被限制，条带逐渐收缩变窄，所以这也是预制胶不建议客户跑太长时间—–密切观察 marker 迁移位置，当小分子条带到达凝胶下方 1/3~1/4 处时立即停止电泳，避免过度聚焦。2.部分商品化小分子蛋白 marker（<20 kDa）为了提高稳定性，会添加载体蛋白或修饰基团。若载体蛋白与小分子 marker 的迁移特性差异大，可能导致 marker 条带在聚焦时被 “压缩” 变窄；3.marker 反复冻融会导致部分降解，降解片段与完整分子共同迁移，也可能呈现 “窄而模糊” 的条带。4.电泳缓冲液用的对不对，不对也可能会出现，正常10KD应该是能出来的也不会越来越窄。

这个电泳槽可以用吗？

预制胶的胶板尺寸10*8，凝胶8.5*7。能容纳胶板宽度在10cm的电泳槽。如常用的伯乐、六一、天能等品牌电泳槽均可以适配。

跑了一会儿不导电了，电流为0。

可能原因如下：1.存在漏液渗液情况，排查一下内槽漏液渗液情况 2.内外槽都灌满液体了，导致电压不稳，外槽只加到2/3即可。

样本上不进去

加样口如果有残胶，可能导致样本上不进去或不沉降，可以在上样前，使用配置好的电泳缓冲液，轻柔的吹洗一下胶孔，这样可以把里面可能有的残胶和残留的保存液清理干净，样本就好沉降了。如果冲洗后仍有残胶，可以尝试使用10uL枪头或者注射器针头，把残胶小心挑出去。

边孔倾斜的。

这个是胶的边缘效应导致的。凝胶在长时间保存时，会缓慢吸收保存液水分，导致凝胶溶胀，塑料板中间应力最低，所以型变量会由两边到中间逐渐增加，微观上是三维孔状由两边向中间逐渐变大，现象上是越靠近中间电泳速度越快。可以用120 V电压来跑胶，可一定程度优化，或者两边孔空出来或者点些残样等保护下也可以。

烧胶和黄化。

黄化情况原理：蛋白是带负电的，从上往下走，如果缓冲液能力不强，那么H离子过多，就会是溶液变成酸性，溴酚蓝正常是蓝色的，在酸性条件下就会变黄。
可能原因：1.电泳液ph变化导致，反复使用的电泳液ph变化，会导致电泳过程中发热和黄化；2.电泳槽的电阻丝老化；3.电泳槽之前用过不同体系的胶，更换过不同体系的电泳缓冲液，可能有之前的离子残留，会影响实验效果。
建议优化方法：1.有一些品牌的电泳槽由于产品设计原因，比较容易黄化，可以试试更换电泳槽，比如用进口的或天能的，或者将电泳缓冲液按照1.5×浓度使用。如果电泳过程中会产热，可冰浴进行凝胶电泳。2.使用配套缓冲液，并且配置新鲜的电泳缓冲液使用。3.更换不同体系的胶前，彻底清洁电泳槽，使用纯水多次润洗，以免不同离子干扰。3.内槽加满缓冲液，观察1-2分钟，不漏液，再加外槽电泳液，至电泳槽的1/3~1/2处即可，不要加满，可能会引起电泳电流不稳定。

溴酚蓝弥散，但Marker正常。

这个情况一般是样本里含有部分核酸和盐成分。比较宽的条带是因为里面可能受到盐成分的影响，盐成分不光会往下电泳，也会往孔道两边电泳，就造成条带宽，旁边的样本也会被挤到变窄。另外就是核酸分子大，难以电泳下去，所以会拖尾，成点状的条带。1、上样之前100℃煮沸3-5min，之后12000rpm离心5min，核酸或者杂质会沉降下去，吸取上清位置蛋白上样。2、尽量减少蛋白质量，（1）蛋白浓度不要太高，可以稀释（2）可以减少上样体积，这两个方法最终大概质量在10-20ug就可以，核酸能被稀释中和掉一部分。

跑胶发烫

正常160v电泳液不会发热。看一下电泳液是不是回收使用的次数多了，里面离子浓度不够，可能电泳能力下降了。这个情况换一下新配置的电泳缓冲液就能改善。另外检查一下电泳槽，清洁一下，擦擦电阻丝等元件，可能会是电泳槽哪里脏了，导致电阻电流增大，从而发热的。另外就是这次跑胶前有没有使用这个电泳才跑甘氨酸体系的胶，里面有其他的离子残留，影响了。可以彻底清洁一下电泳槽，然后纯水冲洗几次。再观察一下内槽是否漏液。如果是出现了漏液，那么条带可能会异常。如果只是电流大，有的时候会条带会不太好看，导致条带模糊等。

含SDS吗

胶中不含SDS。

胶上有裂痕

可能是胶冻了导致的。比如贴在冰箱侧面或出风口等位置，可能导致胶的温度低，可能会被冻裂。冻过的胶无法使用，请更换新的胶使用。

预制胶只能跑变性电泳吗？

预制胶是不含SDS的，可以跑变性也可以跑非变性。但是这款胶的配方是为了变性电泳优化的，非变性胶还涉及到等电点，有的胶会跑不开，因此不太建议客户这样用。如果想尝试，只推荐跑等电点小于7的非变性蛋白，并且使用不含SDS的非变性电泳缓冲液。

可以跑MES吗？

bis-tris这个体系预制胶，可以跑MOPS也可以跑MES，分别用对应的缓冲液就可以。缓冲液配方：Tris6.06g；mops：10.46g；SDS:1g；EDTA:0.3g把这里面MOPS换成MES就是MES缓冲液；MES针对小分子蛋白的。

EMSA预制胶有吗？

可以用MOPS预制胶尝试，搭配TAE Buffer。但是这个胶的配方肯定不是最合适的，要是想用可以少量试试看看，是否适配客户样本。

膜的时候用自己配的转膜液或者快速转膜液都行的对吧

是的，转膜液不分体系。

显影出来背景太黑了根本显不出来。

1、如果是单独转的膜，可以再看一下转膜时间够不够，会不会没完全转上。所以信号低。
2、封闭不完全，适当延长封闭时间。
3、一抗或二抗是否重复使用了，或者使用浓度不合适。可以重新配置一下一抗二抗，增加抗体的孵育时间。充分跟蛋白结合。
4、洗膜是否不充分，适当延长洗膜时间，增加洗膜次数。适当调高振幅。

跑到一半，条带就不懂了。

内槽漏液了，电流不同，导致电泳异常。可以补加内槽电泳液后继续电泳。后续在组装过程中，请先组装胶和内槽，加满电泳液，静置几分钟，看是否漏液，如果不漏液，再加入外槽电泳液。并在电泳过程中持续观察，如有漏液情况，尽快补加内槽电泳液。

同样的蛋白用预制胶就是点状的，用手灌胶没问题。

点状条带是典型的样本污染的情况。预制胶相对于手灌胶替换，优点组分少，无毒，节省时间，但是商品化的成品必然和手灌胶现配的差一些包容性问题，大家针对替换手灌胶的客户可以作为提醒和客户说一下：对于核酸承载力我们预制胶比手灌胶低了10-20%承受力，因为我们PH和手灌胶不一样，另外我们是商品化东西，不是现配的，因此如果客户提取蛋白里面比如有10%核酸污染的话，用手灌胶可能看不出来，但是预制胶就表现的明显了，这个情况原理是这样的：提蛋白的过程实际是裂解细胞的过程，蛋白大部分在细胞质里面，如果客户确认只提细胞质蛋白，不管用ripa强中弱，通过控制时间只提取出来细胞质蛋白，但是很少有客户时间能掌控的那么好，在往里就是细胞核，如果裂解时间长细胞核里面基因组就会出来了，或者有的客户比如提的就是核蛋白，或者组蛋白，那必然就得裂解到细胞核，才能释放蛋白，这样核酸也就必然出来了，所以大部分提的客户都会带一些核酸，就是多少的问题，少的话我们能承载，多的话可能就影响条带了，因为核酸大，如果胶承载不了的话就不往下走，或者走的慢，蛋白快条带就异常了，那么针对这一现象你们可以直接和客户说让客户就吸取底部得样本上样，如果上样之后没有异常那肯定就没问题，但是如果异常那用不用肯定老师会自己在衡量了，但是也不是说就是不能用，解决办法：1.核酸大，如果特别严重上样之前可以100℃煮沸3-5min，之后12000rpm离心5min，吸取上清，如果不严重直接离心不用煮沸2.尽量减少蛋白质量，（1）蛋白浓度不要太高，可以稀释（2）可以减少上样体积，这两个方法最终大概质量在10-20ug就可以，核酸能被稀释中和掉一部分；然后最根本的解决办法就是提取蛋白：1.提取的时候可以加核酸酶2.提取过程可以多离心几次，3次左右，一次15min，得到的上清粘度越低越好分离3.其实有的时候没必要一定用ripa强，尤其细胞特别好裂解，也可以选择一些温柔的裂解液4.可以提蛋白的时候加点核酸酶抑制剂

咱们预制胶过期了还能用吗

建议是效期内使用，过期之后边缘效应可能会明显了，但应该也能跑出来条带，如果不想浪费也可以试试。

预制胶一侧歪了

电流不稳定影响了，或者夹子受力不均匀导致的。如果电泳过程发热，可能是缓冲液电泳能力下降了。建议更换新鲜配制的电泳缓冲液。

为啥非变性只能跑7以内的

变性和非变性胶区别：
1、工作原理不同：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或称为活性电泳是在不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开。
2、功能不同：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度主要由分子量决定。
3、特点不同：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳时通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确的寡核苷酸从凝胶上切下。（对于蛋白，非变性胶中蛋白保持活性，其迁移率与分子量、等电点和形状等均有关；而变性胶会加入变性剂如SDS，使蛋白变性并带上相同密度的负电荷，从而迁移率只与分子量有关。对于DNA，变性应该是完全使双链间氢键断裂，无其他二级结构，使迁移率只与分子量有关；非变性相反，有其他二级结构，分子量也只是迁移率的一个区分度。

上层胶无法将条带压成一条线

1.（1）缓冲液中SDS浓度不足或离子强度过低，实际还是缓冲液重复次数或者是否体系不对，导致样本迁移不受控。（2）电压设置是不是太高了，或者漏液等造成局部电压过高，导致样本浓缩的不好，（3）样本中含高浓度盐分，导致条带下不去，压缩不好，勉强往下走的的不好
2.（1）电流不均一，电场不均一，小分子量Marker迁移过快，条带扩散（2）电泳产热过多，局部变热，导致胶局部变形，条带扩散或扭曲。（3）缓冲液重复次数多，导致导电性不足，导致迁移路径扭曲3.（1）高电压导致胶中部温度和边缘温度不均一，中部迁移快或者边缘快，这样就有尖尖（2）样本中残留颗粒或高浓度盐分导致局部电场紊乱

marker没分开

1.电压过高导致产热，条带扭曲或压缩；2.时间不足使Marker未完全分离3.电泳缓冲液不匹配，体系不对，或者重复次数过多4.电泳槽漏液，电压不稳，条带下不去

蛋白条带呈笑脸状态

可能原因：一是电泳速度过快， 可通过减少电压等减慢电泳速度，120v恒压 或者是80v转120v也可以。二是电泳温度过高，使得胶变形，内槽电泳液现用现配，内槽不要漏液，外槽电泳液只可以用2-3次，外槽是三分之二的电泳液，不要灌满。

预制胶使用的注意事项

Tip1：预制胶请一定置于2-8度保存，避免受冻。受冻后的预制胶可能会出现胶和胶板之有气泡，会影响跑胶后的蛋白条带；
Tip2：取用预制胶之前请先检查外包装袋是否有破碎漏液等，避免内部保存液不足导致预制胶缩胶或胶与胶板分离情况；
Tip3：预制胶底部有蓝色胶条，使用前请务必撕掉在安装，否则会导致电泳体系不通电，从而电泳仪报警且条带跑不下去；
Tip4：拔梳子时尽量双手拇指抵住齿梳两端匀速向外拔出齿梳，避免带歪胶孔；
Tip5：预制胶胶板兼容目前市场大多数电泳槽，包括：Bio-Rad Mini-PROTEAN (II/3/Tetra System)；Hoefer Mighty Small (SE250/SE260/SE280)；Life Technology Novex Mini-Cell (请与免费提供的特制挡板配合使用)；北京六一DYCZ-25E、DYCZ-24DN等；君意东方JY-SCZ2+；天能VE180；以及其它能容纳胶板10cm*8cm的电泳槽。但是注意：密封条上边缘有突起的仪器需要反装胶条，例如伯乐仪器；
Tip6：内槽电泳液推荐放新配置的，外槽的电泳液可重复使用，但尽量不要超过3次，期间如发现跑胶条带效果不理想，请更换新鲜配置的电泳液；
Tip7：内槽电泳液请一定要加满，外槽电泳液一般加到1/3处位置即可，避免内外槽电泳液高度连通，导致电泳短路。
Tip8：请尽量枪头垂直悬空加入蛋白样本，注意避免枪头戳破上样孔或撑开胶和胶板导致两种分离开；
Tip9：MOPS预制胶可以使用恒压160V跑到底，如果客户想压一压条带可以先80v，再转120V跑胶

想问一下这个挡板中间怎么是空的？

因为中间是正常按安装预制胶等的，只是对于有些电泳槽比较大或者厚的尺寸，单独安装预制胶夹不紧，这是可以加个挡板伯乐电泳槽，如伯乐的Bio-Rad Mini-PROTEAN仪器等一般不需要额外加挡板，把其中绿色胶条反装一下，避免漏液。

预制胶挡板怎么使用

放在预制胶外侧，插进电泳槽内即可，先加内槽电泳液，静置2-3分钟，观察没有漏液即可上样。

预制胶跑到中间有一条透明的带

透明带是很多前导离子聚集产生的，不影响电泳。

预制胶最大上样量。

10孔的最大上样是60ul，但是如果用大量程的枪，因为冲力比较大，可能会不好上，可以用20ul或者10ul的多上几次。12孔胶的最大上样量为50μl，15孔胶的最大上样量为30μl。

梯度胶容易出现双条带

这种情况主要是由于样本和靶标自身特性以及WB实验流程中的样本制备、抗体孵育和封闭等具体实验细节问题所引起的，可能原因有：1. 蛋白样本降解，导致检测蛋白质分子量降低或多带现象，可以通过重新提取蛋白改善，提取过程中保持好低温和加入足量的蛋白酶抑制剂；2. 一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带，可以通过降低抗体浓度和/或孵育时间解决；3. 非特异性条带，看一下一抗的来源是否与样本有交叉反应，内参抗体一般为多克隆抗体，多克隆抗体本质上是抗体的混合物，如果其他蛋白中恰好有能让混合物中某种抗体结合的抗原位点，就会出现杂带；4. 因为某些蛋白有异构体，所以像梯度胶比固定浓度胶分离效果好的，分的比较细致，就会把异构体显现出来。

浓缩胶多长？

浓缩胶长度1.5cm

跑10kd以下蛋白可以吗？

我司现有浓度都是适合10KD以上的蛋白的分离。

1.5mm和1mm预制胶有什么区别？

1.5mm和1mm凝胶厚度不同，胶薄厚不一样，蛋白承载量不一样，胶越厚承载的蛋白越多。样本最大上样量有些区别，但跑胶条带和最佳分离范围都效果都是一致的，一般跑wb时蛋白样本上样量一般10-30ug就比较合适了，而且同样量的蛋白在厚的胶里面跑电泳，胶越厚转膜时间相对就要更长些，或者做考染时染色和脱色时间也相对长些，所以1.0mm厚度可以满足一般的使用需求，相对也更节省时间些。

缓冲液可以反复使用吗？

内槽需要新鲜配置的，外槽可以使用回收的重复使用，可使用2-3次，不超过5天内使用。

MOPS胶的缓冲液体系配方。

MOPS Running Buffer：50 mM Tris，50mM MOPS，0.1% SDS，1mM EDTA，PH=7.7 （PH不用调pH，按这个配方，配出来的缓冲液的pH值就是在规定范围内7.2-7.8即可，7.7最好，不用特意去调）

MOPS和甘氨酸两个系列预制胶的区别

甘氨酸体系是比较经典的体系，兼容性好些，MOPS体系也就是 Bis-Tris体系跑胶时间比甘氨酸体系更节省时间，条带更锐利平直，边缘效应也会相对改善，而且因为两个配方的PH也不一样，所以稳定性上有区别，条带上肯定有区别，然后MOPS体系能减少聚丙酰胺降解，其实主要还是配方原因，市面上用MOPS体系客户会多一些，但如客户之前习惯使用甘氨酸体系的也可以选择使用。

预制胶有dtt等还原剂吗？

预制胶中不含，dtt等还原剂一般在上样缓冲液中。

常温能放多久？

预制胶常温放置一周左右

不同浓度的胶，一起跑，速度会不一样吗？

会的，不同浓度胶电泳速度可能不同。

跑出来的条带粗细不均一。

可能是由于上样量不均匀或样品扩散，可以把所有样本上样量调成一致的，不够的用loading补齐。

配完后有残胶。

有残胶可能是梳子与胶板不是太匹配或者凝胶期间有松动晃动等。因为是快速成胶的，所以里面可能就形成了残胶或者在胶孔上形成了一层薄膜，可以用缓冲液冲洗下残胶，也可以用枪头把黏连东西挑出去再上样。并且建议客户使用配套的配胶板和梳子，制胶前将制胶板夹紧再进行制胶。

杯子里剩余的上层胶凝胶一直不凝固。

因为杯子里的接触空气，所以相比制胶板里的更不容易凝固，这个是正常的现象。可以轻轻拔一下梳子看一下胶板里的是否凝固完全。

今天制完胶了，用不上了，可以明天用吗？

制备好的胶可以使用保鲜膜或密封袋包好，少量弹洒点水，保持湿润，保证不干（但不能泡在水里，会涨胶）。放置于4℃保存，可以第二天再使用。

溴酚蓝弥散。

溴酚蓝的宽度跟胶的浓度，样本的复杂程度，还有上样量都是有关系。建议将所有样本的上样量及上样体积调整统一。另外也可能是没有浓缩好，浓缩胶过短导致的。

普通型和改良型有什么区别？

体系是一样的，均为Tris-Gly体系凝胶。普通款满足大多数客户的实验要求；改良款效果可以完全对标雅酶，同时价格也相对普通款更高一些，如实验室经费充足可以优先推荐改良款。

跑到后面溴酚蓝变成黄色了。

溴酚蓝变黄是黄化的表现，也就是在正极积累较多氢根离子，酸性下溴酚蓝指示剂有变黄。可能有三个原因：1、电泳缓冲液体系与胶的体系不匹配；2、电泳槽老化或一些国产电泳槽比较容易引起黄化；3、电泳过程中产热、电泳时间过长或电泳液反复使用。
优化方法：1、电泳时低温冰浴，同时也能防止小蛋白弥散。2、电泳条件：可以120V跑全程，一般1h多能完成。3、新鲜配置电泳液，现配现用，同时确认好体系与胶匹配。4、如果上述方法不能改善，可能是由于1×的甘氨酸体系电泳缓冲能力比较弱，所以可以直接用2X的跑。

拔梳子的时候胶孔梳齿容易歪，偶尔还会断。

凝胶时间不够、没有凝固好或过硫酸铵加入不足量，导致胶体较软。

没有收到促凝剂

促凝剂长期保存是-20，和试剂盒保存条件不一样。因此运输包装时候一般也是促凝剂在外面，分开放的。

试剂盒临期了还能用吗？

临期一般效果影响不大的，里面促凝剂需要注意避免反复冻融影响效果，如有凝胶慢的情况可以适当提高些促凝剂用量。

免封闭配胶试剂盒分离胶和浓缩胶之间总是不平。

1、配胶试剂盒的缓冲液和胶液先平衡到室温，颠倒混匀后再进行配胶。
2、上层胶需要在下层胶加完后尽快加入。
3、移动着缓慢加上层胶，会容易出现压线不齐的情况；建议枪头抵住一处，缓慢加入，控制加样力度，尽量慢一些。等待自动流平即可。
4、如上述方法改善情况不佳，可以试试用水压线，使用方法参考普通款需压线配胶试剂盒。
注意：免封闭的压线没有封闭款那么清晰，但是不影响蛋白条带。

考染后脱色脱不干净。

可能是考染液与凝胶不匹配导致的。一般有机的考染液染色后颜色都会更深一些。可以配套我司快速考染液，货号为MA0399。

上层胶颜色过浅

配胶试剂盒中的染料材质是纳米，不溶于水的颗粒。上层胶的染料在经过一段时间的放置后可能会沉降，导致山下层染料浓度不均一。建议使用前恢复至室温，并混匀后使用。

条带拖尾。

可能由以下原因导致：1.样本问题：DNA/RNA污染或盐离子浓度过高；2.凝胶不均一；3.电泳条件：（1）电压过高（2）缓冲液重复利用（3）上样量过大。
优化方法：1.样本上样前100℃煮3-5min，之后12000Rpm，离心5min，取上清位置上样。2.配胶前将各组分取出，平衡至室温。充分混匀后进行制胶。3.降低电压，使用新鲜配置并充分溶解的对应体系缓冲液进行电泳。

凝胶速度很慢。

PAGE凝胶的凝聚速度与温度和过硫酸铵用量呈正相关性，温度越高、过硫酸铵用量越大则PAGE凝胶的凝聚速度越快。在配胶前，请将本试剂盒从冰箱拿出并放置恢复至室温。配胶的时候可以适当增加一点过硫酸铵的量，充分混匀后加到胶板中。请于室温下凝胶，如冬季温度较低，或者空调温度较低，会影响凝胶速度，导致凝胶缓慢。

电泳的时候需要加冰吗？

电泳可以电泳槽外面放置冰块以降低温度，避免蛋白降解。

凝胶考染后还能转膜吗？

不可以了。

跑胶一般需要多长时间？

1h左右，电压越低时间相对越长。

制胶有气泡。

为了保证迁移率，里面含表面活性剂成分，配胶过程可能产生微小气泡，建议操作时尽量轻柔一些，不要剧烈搅拌混匀，移液器混匀时避免带入气泡等。在灌胶过程中不要另外可能是气体溶解度的问题，温度越高气体溶解度越低导致的；建议每次操作前将试剂从4度拿出来后，平衡到室温，再进行制胶。凝胶过程温度过高可能导致胶液固化速度加快，从而气泡产生，如果室内空调温度较高可以减少过硫酸铵用量。

配胶试剂盒是非还原型的吗？

此系列SDS-PAGE凝胶试剂盒均含有少量还原剂。

转膜使用什么体系的转膜缓冲液？

转膜不区分缓冲液体系。

封闭款压线，除了水之外可以使用其他试剂吗？比如酒精或者异丙醇。

压线使用纯水、乙醇或异丙醇都可以用于压线。

免封闭是指的配胶不需要还是后续做WB不需要牛奶封闭了？

是指的配胶过程中不用水压线封闭了，直接一步法配胶。后续WB操作封闭还是正常做的。

能承受住250V的电压吗？

电压过高会导致条带弥散，建议使用150-200V恒压电泳。

电泳条带整体呈弧形或其他不规则形状。

这种情况一般是内槽漏液导致的，可以检查一下内槽液面是否有下降，如电泳过程中观察有液面有下降，但条带还没有异常，可以尝试重新安装，或及时补充内槽电泳缓冲液。电泳槽安装过程中，首先安装凝胶，加入内槽电泳缓冲液，等待3-5分钟，观察内槽不漏液后，再加外槽电泳液。

MA0071/配胶试剂盒里的分离胶溶液是果冻状/固体/凝固的形式的了。

可能是剧烈震荡或者储存不当，诱发丙烯酰胺提前聚合了，不能使用了，请开封新的使用。

配胶试剂盒的凝固时间是多长？

免封闭款：约15min左右，普通需要压线款：约下层胶 15min左右+上层胶 15min左右。胶时间也受温度，促凝剂等多方面因素影响，如室内温度低相对凝胶时间会长些。

条带粗细不均匀，有宽有窄。

1.上样蛋白量不一致，举个例子第一孔上10ul，第二孔上2ul，相差较大，就会出现这个情况，解决：一个是把蛋白母液稀释，稀释成一样倍数之后再上样，另一个是在上的少的蛋白里面补loading buffer，让上样量一样；2.上样不均匀：样品分布不均，比如样本里面有杂质，这次吸取的带杂质，下一次吸取的不带，解决：每次上样前离心样本，吸取上清；3.上样量过多，导致蛋白质浓度过高，条带重叠堆积，解决：减少上样量。

快速配胶试剂盒放在-20℃保存了，还能用吗？

请先尝试解冻，解冻后观察是否有沉淀，如果有沉淀可以尝试25-37℃水浴复溶。如全部溶解可以尝试使用。如不影响效果后续再正常使用。

条带弥散。

可能导致电泳条带弥散的原因如下：1.电泳槽内的电泳液存在漏液现象。2.电泳液使用次数过多或者SDS量添加不足，电泳液配方是0.1%的SDS，回收的电泳缓冲液可以加在外槽重复使用2-3次，内槽建议每次使用新鲜配置的缓冲液。3.外槽电泳液过多，一般加1/3-2/3，不要内外一样高，电流循环不起来。4.上样体积过大/样本中的盐离子浓度过高。5.胶凝固过程中出现不均匀现象，比如有气泡等。6.上层胶用小电压跑 把条带压直之后，再换大电压如80V转120V。

促凝剂可以保存在4℃吗？

过硫酸铵溶液在2-8℃大概稳定保存三个月，时间更久建议-20度保存。建议根据用量进行分装。

MA0159 是用什么电压跑呢？

建议设置电压为80V转120V。

浓缩胶和分离胶的pH分别是多少?

浓缩胶的pH为6.8。分离胶的pH为8.5～8.8。

免封闭的能封闭着用吗？

可以的，面封闭款可以按照封闭款的使用方法，使用水进行压线，再加入浓缩胶。

MA0159和MA0172的区别是什么？

MA0172为非变性电泳凝胶制备试剂盒，MA0159为变性电泳凝胶制备试剂盒，两款都是最基础的配胶试剂盒，需要配胶时间较长，相当于把平时自配手灌胶的各个组分搭配在一起组成的试剂盒，使用起来会比较方便。MA0172，非变性电泳，适合的蛋白类型是等电点小于7的酸性蛋白，碱性蛋白不适合，需要用我司BN体系那种试剂盒进行。MA0172，非变性电泳需要搭配对应的非变性电泳液，非变性上样缓冲液，非变性marker等进行使用。MA0159为变性电泳，需要搭配对应的变性电泳液，上样缓冲液，Marker等进行使用。

配的胶太脆的什么原因？

尽量不要暴露在空气中太久，促凝剂可以适当减量。

使用配胶试剂盒跑胶条带弯曲。

配胶时玻璃板用洗洁精清洗干净；2. 在配胶前，请将本试剂盒从冰箱拿出并放置恢复至室温，可有效减少因液体溶解气体不能及时排出而造成的凝胶中气泡的产生；3. 胶和电泳液现用现配，电泳槽内槽倒入足够的电泳缓冲液，内槽电泳缓冲液覆盖上样孔，确保内槽不漏液后再加外槽电泳液，外槽的电泳液加到1/3液面处即可，最高不可漫过胶板；4. 样本里面有不溶性颗粒的话 也会导致条带变形，建议上样前将蛋白样品短暂离心后，取上清上样；5. 常温电泳，电压80v转120v 或者是恒压160v电泳，电泳过程中可以关注一下电泳电流的变化，电流不均一或者玻璃板有缺口等都会导致条带变形；6.  转膜时保证胶和膜贴合完全。

跑出来杂蛋白多。

①膜封闭不够，建议延长封闭的时间 ②一抗/二抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度 4℃过夜孵育 ③ 膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润， 使用镊子夹取膜 ④检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。⑤一抗特异性不高，出现非特异性结合，可能是与封闭试剂发生非特异性的结合； 或者配的奶粉没有充分溶解，奶粉团粘在膜上而没洗干净 ⑥胶浓度不适合，没有得到很好的分离，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。 同时注意一下转膜温度和时间。

试剂盒里改良过硫酸铵的浓度

按照说明书配方比例添加即可使用，具体浓度涉及配方暂时不公开

SDS-PAGE配胶试剂盒可以跑非变性吗？

凝胶配方中不含SDS，理论上也可以做非变性的。但需要客户自备不含SDS的电泳缓冲液。如果客户尝试跑非变性蛋白，这个跑等电点小于7的蛋白样本，等电点大于7的就需要用我司Blue/Clear非变性试剂盒。

条带锯齿状。

可能是胶没混匀导致的。配胶之前把配胶液复温一下，然后上下颠倒几次，混匀之后再添加各个组分，各个组分混匀之后，再加到胶板里。

过硫酸铵可以水浴溶解吗？

过硫酸铵不太稳定，不建议水浴溶解。可以室温解冻，如需水浴溶解建议水温不超过25℃，融化后尽快取出。

是什么体系的？

Tris-甘氨酸电泳体系。

上层胶会缩孔。

一定范围温度越高，凝胶速度越快。而氧气抑制凝固，混匀的时候，切记不要混入过多空气，混入过多空气可能会影响胶的凝固。点样孔缩胶，可能是由于梳子不匹配或者破损，密封不好，氧气抑制胶的凝固等情况影响。

需要封闭款和免封闭款的区别是什么？

一款需要水压线封闭，一款是不需要压线，免封闭的，需要水压线的这款需要等下层胶凝固后再加上层胶，凝固后再用，而免封闭款加入下层胶后就立即加入上层胶，无需等待下层胶凝固，时间会更节省，但是对操作要求可能相对高些，有时免封闭的客户操作加液过慢或者移液器打入力量过大会有压线不平的情况，操作需要注意下细节。

普通电泳缓冲液能重复利用多少次？

外槽可以重复使用2-3次，尽量在一周内使用。

电压多少合适？

电压可以根据胶的说明书进行设置。我司一般使用150v全程。也可以使用80V转120V。

有能跑10多KDa蛋白的胶吗？

十几kda的小蛋白可以推荐15％浓度胶。

浓缩胶大概需要多高？

建议浓缩胶的高度在1.5cm左右，配置1.0mm厚度大概需要加1.5毫升左右，1.5mm厚度大概2毫升左右。

浓缩胶浓度多大？

浓缩胶是4%。

marker和样本整体条带呈拱形。

这种情况一般是外槽电泳液较多或者内槽漏液导致的。如外槽电泳缓冲液没过玻璃板，建议减少电泳液用量，外槽在三分之一位置就可以了，这样既可以节省电泳液，也可以避免因内外槽加的过多导致内外槽连通，而导致电流不稳。同时，注意内槽是否有轻微漏液情况。这个情况也会导致电泳条带异常呈拱形。可以在装好胶板后，先加入内槽电泳缓冲液，观察3分钟左右，如不漏液，再加入外槽电泳缓冲液。

配胶试剂盒室温能放多久？

37℃条件下，10天是稳定的，不会影响使用。

跑胶需要多长时间？

120v恒压需要1小时左右，150v恒压大概50分钟。

抑制剂可以4度保存吗？

建议-20度保存，4度长期保存不稳定。建议将其分装成小份，这样解冻速度比较快，方便使用。

RIPA这个研磨组织要加液氮吗？

不需要，先把组织剪碎，然后匀浆器匀浆，冰上操作。

植物裂解用哪款

可以试下MA1305 SDS裂解液或者MA0151 RIPA强，由于我司暂时没有测试过植物样本的裂解效果，更常用于细胞或动物的样本，如果客户想使用，建议先小试确定一下使用效果。

这个培养瓶一般需要加多少RIPA呢?

T25瓶可以加500ul左右，加入后摇匀，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。

用RIPA强和弱提膜蛋白，做COIP都不行

RIPA强和弱都不能单独提取膜蛋白，RIPA提取的是全蛋白，包括膜蛋白，但因为有浆蛋白存在，膜蛋白浓度很低不足于后面的检测。而且RIPA裂解的，不能用于CO-IP。CO-IP的裂解液比较适合用NP40或者曲拉通100这类非离子型的去垢剂，pipa主要成分是SDS，裂解效果好，但是无法维持天然蛋白构象，不太适合做co-ip。
可以参考我们自用的膜蛋白提取方法，但暂时没有试过做CO-IP。配置方法和实验步骤可发客户参考，请客户自行核实，里面是否有不合适的成分，再判断一下是否可用。
膜蛋白提取方法：
1) 取细胞沉淀，PBS 重悬，每种细胞取细胞数相对等量的细胞悬液，离心去上清。
2) 向细胞沉淀中加入1ml BufferA 重悬，放入-80℃，5min，拿出后放入室温融化，反复5 次。镜下观察细胞磨碎大于80%。700g 离心，去除未磨碎的细。
3) 尽量吸取上清，向沉淀内加入Buffer B 溶液，间隔2min，涡轮震荡15s，重复15 次，之后14000g 离心30min，离心后上清即为细胞膜蛋白。
注：Buffer A 配方：10mM PIPES,5mM EDTA,1mM PMSF，适量蛋白酶抑制剂（cocktail），pH 值7.4
Buffer B 配方：10mM PIPES,5mM EDTA,100mM NaCl，3mM MgCl,0.5% 曲拉通-100，0.1% SDS,5mM CHAPS, 1mM PMSF，适量蛋白酶抑制剂（cocktail），pH 值：7.4

RIPA强，pH多少？

ph：7.5-8.0。

这三款RIPA，强中弱怎么选择？

如果裂解组织，可以选择RIPA强，如果裂解细胞可以选择RIPA中或者强都可以，如果只想买一款那可以用RIPA强的，细胞组织都行。

含有蛋白酶抑制剂或者磷酸酶抑制剂吗？

不含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，含有一只单独的PMSF可以在裂解细胞前加入到裂解液中，起到抑制蛋白酶的作用。也可以使用单独的蛋白酶抑制剂或者磷酸酶抑制剂搭配使用。

里面EDTA含量是多少？

EDTA浓度不公开。

提肿瘤组织蛋白用哪款裂解液？

组织蛋白提取最常用的是RIPA强，货号MA0151。

6孔板细胞用多少

通常 6 孔板每孔细胞加入150uL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200uL或 250uL。

置于-20度了，还能用吗？

可以的，可以解冻后看下是否有析出，其中SDS容易析出，如有析出可以37℃水浴充分溶解下再试试。

提取完的蛋白很粘稠。

可能是离心或裂解时间过长，样品中的基因组出来了，透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物，比较粘稠。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。建议后续裂解时间可以适当缩短些。此样本如后续用于WB检测，建议上样前100℃煮沸5min，12000rpm离心5min，吸取上清上样，避免基因组对于跑胶的影响。

可以用于做ELISA实验吗？

不太适用，裂解液中含SDS一般对ELISA检测有影响，另外每个ELISA检测试剂成分不一样，对使用要求也不同，可以询问一下ELISA的试剂厂家，他们的试剂盒对细胞裂解液的推荐。

我买了MA0151和MB2678,你们家ma0151带了PMSF，我加MB2678还用加这个PMSF么？

不用了，MB2678是混合物，抑制剂种类比PMSF更全面，如果加MB2678就不用再加PMSF了。一般PMSF会满足大部分需求，但MB2678更全，如果还有磷酸化蛋白需要再加MB12707。

裂解精子细胞选择那种？

可以看下MA0151这款，效果比较好，一般离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。

PMSF可以一次性加到裂解液里吗？

现配现用，配置后冰上放置，尽快加入到细胞或者组织中。

PMSF，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，一次用不完，可以放四度吗？

可以分装成小容量的 然后放-20保存。

裂解出来的蛋白量少。

1、细胞数量较少，加的裂解液体积多了，导致蛋白被稀释了，6孔板建议每孔加80-100微升的裂解液；或者如果是六孔板，可以多做几个复孔，将2-3个孔的细胞收集到一起进行裂解。2、蛋白降解，建议蛋白提取全程低温，可以冰上裂解操作；蛋白放置时间久了；需要另加蛋白酶抑制剂，如PMSF等，PMSF要现用现配，避免水解，影响保护效果，可以试一下1：50的比例。3、可以在裂解时间隔5min左右摇晃混匀，或者延长下裂解时间，促进裂解效果。

能够裂解细胞，但不会破坏蛋白结构，适合用来跑native page 观察二聚体的那种裂解液 ，这种哪个比较合适呢

RIPA裂解液（弱）MA0153；NP-40 MA0156;WB及IP裂解液 MB9900，这些不含SDS的，都可以，都是在非变性条件下裂解细胞的裂解液。

细胞裂解多长时间？1-2s就可以吗？

根据细胞不同，裂解时间不同，一般5-15分钟，可以在裂解过程镜下看大部分细胞裂解就可以了，可以加入裂解液后用移液器吹打混匀，使细胞和裂解液充分接触。对于不好裂解的细胞可以适当延长裂解时间。可以延长至30分钟。

提取后的蛋白不变性可以放多久？

如果短期内使用可-20℃保存，长期需要再-80℃存放。

裂解液带的PMSF有些析出了。

25-37℃水浴短时间内，溶解后立即取出，不要放置过久，避免降解。

可以用于做双酶实验还有ATP检测的细胞裂解吗？

不行，裂解效果太强了，一般双酶实验检测ATP实验都是试剂盒里面带裂解成分，使用比较温和的裂解液。ripa等会使荧光素酶失活，可以看一下MA0523萤光素酶报告基因细胞裂解液（通用型）。

客户用的是Bradford蛋白定量，是不是不能用MA0151。

不能使用普通的Bradford定量检测试剂盒。除非Bradford是兼容型的，例如我司MA0079。

电泳时候会有一条黄色的，这个是多大的？

是的，这个是440KD的，这个黄色印记是因为marker中含有铁离子，使得电泳后在胶上可见淡黄色，其中440 kD颜色更深，能在跑胶的时候看到淡黄色印记。

Marker只能看到一条带。

此款Marker是非预染的，因此跑胶的时候看不见，只能看见溴酚蓝的位置。跑胶后会看到一个黄色印记，这个黄色印记是因为marker中含有铁离子，使得电泳后在胶上可见淡黄色，其中440 kD颜色更深，能在跑胶的时候看到淡黄色印记。Marker本身为非预染Marker，因此跑胶过程中是看不见条带的。需要使用考染进行染色后观察。

跑BN体系有异常，条带多了几条浅的

在非变性条件下，蛋白的迁移与蛋白的电荷、蛋白形状以及蛋白分子量都有关。如想更准确的判断目的蛋白在非变性蛋白电泳中的大致分子量大小，推荐使用Tris-Gly（8%分离胶浓度），本产品在此体系中条带位置更准确；在其他分离浓度或电泳体系中，可能会出现分离异常的现象。原因是由于体系pH值和梯度分离造成的，360kD的蛋白等电点（PI）接近于7，在电泳时所带负电荷不均一，容易造成迁移率不一致现象。目前是没有完美适配BN page的marker，咱们这个在bn page中迁移率不一定准确。非变性电泳中，蛋白分子量的确定应该是在不同凝胶浓度下，确定出蛋白的Rf值，绘制出凝胶浓度对Rf的曲线从而判定蛋白的分子量。

使用BN/CN体系电泳，转膜就什么也没有了。

转膜后用丽春红染色液染膜，可以看到Marker条带，顺便可以检测转膜效率，然而要注意的是丽春红染色灵敏度比较低，可能不能完全看到完整的Marker条带。黄色印记一般转膜是可以转过去的，能验证转膜是否完全了。如果转膜后就没有了，建议最好用丽春红验证一下是否转膜完全了。如果是洗膜的时候没有了，那不要紧的，洗掉了也没关系，因为本身这个黄色的不是条带。建议客户后续将marker条带切下来，使用考染染色，最后结果和显影的条带再进行merge。我司转膜条件可供参考：我们用的自己公司的快速转膜液，这款转膜液是不含SDS的，Meilunbio® Western快速转膜液（MA0121）进行转膜，稳流400 mA ，45 min，冰浴。普通的转膜液我们没试过。如果客户用自己的转膜液，去掉SDS成分，按照平时转膜的条件设置试试。

搭配哪个试剂盒使用？

非变性蛋白marker（MA0353/MA0352）是与MA0172的非变性配胶试剂盒搭配使用的，同为Tris-甘氨酸体系。而MA0470试剂盒是MOPS体系的，研发实验室通过实验结果发现，搭配使用后，marker位置会发生改变（具体结果影响因人而异）。若想搭配使用，可以推荐MA0352试试。

丽春红显色不好，还可以用其他办法吗

丽春红的灵敏度有限，可以跑胶后用考马斯亮蓝进行染色看条带，可同期跑2块胶，一块做考染，一块胶正常转膜操作，之后根据考染marker对比下相应条带位置。

能否使用Bis-tris/Tricine体系？

不太适配，这款适配甘氨酸体系的，其他体系中条带可能会有异常，如果尝试建议小试。

可能会有特异性结合吗？

出现这种情况是有可能的，如果marker也含有与抗原表位相似的结构就会出现条带。

蛋白浓度是多少？

蛋白量一般约0.2-0.4ug，批次间有些差异，都是在0.1～1微克这个数量级。

marker不会被剥离液剥掉吧？

不会完全剥脱掉的，可能相比未做剥脱处理的会浅一点。

咱的蛋白marker 4度保存的话能放多久啊？

4℃建议一周以内，长期保存建议-20℃。

用TBST洗PVDF膜的过程中会出现marker越来越淡的情况，可能是什么原因？

TBST中的Tween-20是一种非离子表面活性剂，可以增加膜上蛋白质的洗脱能力。如果洗涤时间过长或次数过多，可能会导致红色和绿色条带上的染料被过度洗脱，过度洗脱有可能整体或者某些条带变浅；且marker是含染料的，部分预染Marker染料（如亮蓝）遇SDS、还原剂（DTT/β-Me）等就会稳定性下降，所以就会越洗越浅，这是染料的特性，加上如果过度洗脱或者转膜过热等条件不对的话也会影响。

为什么marker的一个条带在不同缓冲液体系标记的是不同kDa?

同一种预染蛋白Marker在不同缓冲体系、不同胶浓度的迁移率是不一样的 所有预染蛋白Marker的表观分子量都会因缓冲条件的不同而发生变化，所以应根据所用缓冲体系使用相匹配的表观分子量，来更准确地定位目标蛋白。

上了5ul，条带特别粗。

正常的，可以少上一些，降低到3ul会好很多。

Marker不准。

上下差一点儿正常的，我们marker位置是和themo26614非预染对比的。但是因为预染偶连染料了，会有一定误差，thermo的预染蛋白marker也有误差，我们测试过，也问过赛默飞的技术。因为预染蛋白Marker通过与染料共价偶联来实现蛋白的可见性，染料本身的分子量和电荷会对大小标定造成一定影响，在不同的电泳缓冲条件下，蛋白条带的迁移会产生些许偏差，不太适合精准定位蛋白。但是因为使用方便，Western Blot试验过程中，进行蛋白分子量估算、确认凝胶迁移和估算转膜效率是够用的。

会杂上His吗？

MA0342是his抗性的，如果用His的抗体就会杂上，MA26616和MA26619是不带his标签的，一般不会杂出来。

能曝光出来吗？

正常不能显影出来。可以在机器上预览，然后曝光带预览图，Marker就可以Merge到一起。

marker拖尾。

在此基础上减少些上样量，比如现在5ul，可以用3ul试试，这样也更节省marker，另跑电泳时候注意下避免过热影响大分子条带，可以加冰处理，电泳条件可以先80V压一压，再转恒压120V跑。

会跟抗体结合。

蛋白Marker每一个条带是单一纯化的蛋白，相对于目的蛋白其在膜上含量很高。所以如果抗体浓度以及抗体孵育的时间不合适，容易发生Marker蛋白和抗体非特异性结合，从而曝光出条带。可以减少Marker上样量、降低抗体浓度或者减少孵育时间、加强封闭或增加洗膜次数来优化。

条带缺失，条带弥散。没有条带。

蛋白Marker条带缺失、弥散可能是降解了，有可能污染影响或者储存不当、反复冻融等导致部分蛋白降解了。因此建议Marker可以分装储存。可以同时看一下样本条带是否正常，排除跑胶过程的影响因素。看是否是由于电压过高、电泳时间长或电泳温度高等因素导致的。

条带颜色浅。

如上样量较少，可以先尝试增加上样量。另外可能和缓冲液、稀释液，洗涤液的pH有关，ph变化等因素导致。跑胶和转膜的时候可以加冰，避免温度过高导致蛋白降解或转印过度。

转膜完就不清楚了。

一般是转膜效率低影响，最上面的条带分子量大，转膜时间可以适当延长看下，避免大分子条带没有完全转过来。另外可能跟转膜过程产热有关，比如转膜液重复使用，转膜效果下降，转膜液发热等，导致Marker颜色变浅，此情况建议客户更换新鲜配置的转膜液再次尝试。

二抗孵育后褪色。

跑胶及转膜都正常，说明Marker没有问题。可以关注看下清洗液或者抗体稀释液的ph值，如果pH高了，可能会有这个情况。

Marker需要用loadingbuffer稀释后上样么？

Marker是即用型的，不需要稀释，直接加入到点样孔中即可。

Marker含螯合剂么？

含有螯合剂。

4℃可以放多久？

我司测试过4℃保存3天，跑胶没有问题。但是冰箱控温情况不同，为避免降解，不建议4℃长期放置，建议分装后储存于-20℃。

预染彩虹蛋白marker (10-190KD)平时使用量

推荐使用量5ul，如果觉得条带颜色深，能看清就可以也可以3ul。

marker越跑越宽

不管是上窄下宽还是上宽下窄都是和整个电泳体系（包括loading、样品、胶、电泳液）的离子解离程度和含量有关的。如果整个体系后期在分离小蛋白的时候剩余的离子迁移速度快，那么蛋白条带就有可能因为上下的力被压宽；如果整个体系后期在分离小蛋白的时候剩余的离子迁移速度慢，那么蛋白条带就有可能因为上下的力被拉窄。这里之所以考虑整个电泳体系，是因为不同的样品在同样的试剂条件下表现不同，如细胞样品更容易上下宽窄不一（雅酶也同样，只不过表现相反）；同一个样品，如果用不同的loading或电泳液，因为里面成分的差异也会导致条带表现不同，比如如果电泳液中含有加速电泳的离子，那么条带容易越跑越宽。

加多少量呢？

用量要根据膜的大小和容器大小，使用量可以根据TBST洗膜或者封闭时候的体积就可以。

什么时候应该加DTT？

需不需加DTT可以根据您蛋白判断下：1.可以看下您蛋白是不是那种条带特别黑，信号特别强的，比如actin那种，可能就不太容易洗脱，2.也可以加入洗脱液后，洗脱30-60min，检查是否还有残留，有的话需要加入DTT或者B-巯基乙醇，加强洗脱能力。

过曝的膜可以洗掉吗？

过曝的条带是洗不掉的。

没剥离干净。效果不好。

这款是温和型的，pH酸性的，用再生液进行洗脱，洗脱时间的长短主要取决于蛋白质表达量、抗体类型和浓度。如果检测信号不强，可室温振荡洗脱30-60分钟；如果是表达量高、信号强的样品，可按其使用体积，加入终浓度 20mM DTT 或 100mM β-巯基乙醇，室温震荡洗脱30-60 分钟。解决方法：1、加还原剂：β-巯基乙醇，DTT，SDS，TCEP(温和方法把重链轻链打破)；2、换个抗体：比如内参兔抗人，其他蛋白是鼠抗人的，3、高温（我司暂未尝试，最终效果不确定）：在转渍膜中加入适量的调制好的缓冲液，再将缓冲液加热到50-80℃，持续45分钟即可。建议检测表达量较低的目的蛋白，之后用再生液处理并检测表达量高的蛋白。

洗脱后在封闭孵育抗体没办法显影条带了。

这个不适合BSA封闭，用牛奶封闭比较适合。

不推荐使用BSA封闭印迹膜为啥？

使用脱脂奶粉封闭的膜要比使用 BSA 封闭的膜更容易再生，因为bsa的蛋白颗粒基本是同样大小的，但是脱脂奶粉和牛奶封闭的话，颗粒有大有小，会更适合再生。因此脱脂奶粉会比BSA封闭，背景和条带都会好一些。

有没有什么优化的方法

可以加入终浓度 20mM DTT 或 100mM β-巯基乙醇，加强洗脱能力。

有絮状物正常吗？

可能是析出导致的，可37℃加热5min以促进溶解。避免冰箱储存贴边不小心冻到影响。

蛋白印记膜再生液可回收吗？

可回收使用2-3次。

蛋白印迹膜再生液这个产品的PH值数据有没有？

pH：2-2.3。

蛋白印记膜再生液洗脱的时候速度多少合适

没有规定速度 TBST洗膜的速度就可以。

这款产品使用时需要稀释吗？

不需要稀释。

加进去膜变透明

处理后膜会变透明的，这个是正常的。用PBST或TBST漂洗后，膜状态就变成白色正常的了。

现有三款膜再生液，分别适用于哪些情况？

一般做WB的可以推荐MA0181，这款升级优化了，如果是之前感觉咱家MA0181效果不太好的，可以优先推荐MA0188，这款剥脱能力更强；以上两款做PVDF膜效果更好，如果做NC膜MA0189这款相对更好，但其效果相比上两款弱一些温和些。

放在-20度了，有影响吗？

没事儿的，我们做过-20保存的稳定性测试，-20℃放置14天也不影响使用效果。拿出来放2-8度就可以。

洗膜液能洗内参吗

可以，官网展示内容即为剥离内参效果。

最小检出限到底是多少?

最低能到25ug/mL，检测范围是25-1000ug/mL。

有需要避光的成分吗？

BSA配完液体尽量避光，用铝箔纸包上即可。

样本里有很高的EDTA可以用么？

不行，BCA法测定蛋白浓度前，请保证EDTA浓度≤10mM; DTT浓度≤1mM，2-ME≤0.01%，如果太高需要用Bradford蛋白浓度测定试剂盒MA0081，如果里面还有去垢剂SDS、Triton X-100、Tween 20、 Tween 80等那就用MA0079都兼容。

跟Bradford法有什么区别？

与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响，对于5%以内的SDS、Triton X-100、Tween 20、 Tween 80都具有非常好的兼容性。

怎么绘制标准曲线？

使用酶标仪测定 562nm 的吸光值。以蛋白浓度和OD值为横纵坐标，建立线性方程和R2，带入未知样本测得的OD值，即可计算出蛋白浓度。

MA0082里的bsa 没了 ，可以用MB4219替代么？

可以用MB4219配置后使用。用生理盐水或者pbs配置。

A液结晶正常么？

不正常，可能冻过，冻过之后可能会容易析出，析出了常温也恢复不了，但是水浴应该是可以化的，里面都是无机盐，化了不影响质量，30或者37°水浴，别开盖化，都化开就能用。

A液和B液混一起是什么颜色的？

蓝色。

做了几次差异大

线性方程系数不同实验下会有区别，每次不能完全重复出一样的。所以测定未知样本时，要每次都做标准准线，然后根据本次的标准曲线进行计算，这样结果相对准确。这个是因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次的数值肯定会有所不同的。只要标准曲线能达到两个9以上，就可以认为结果是可靠的。

能用于植物蛋白含量检测吗

理论上可以，但是还要检查蛋白有没有颜色，因为是测吸光度，如果蛋白有颜色可能就不准确了。

含防腐剂吗？

不含。

蛋白变性还能测吗

蛋白变性后不能进行BCA定量了，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成—价铜离子(biuretreaction)，一价铜离子和独特的BCASolutionA(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。蛋白变性后由于加入溴酚蓝显色试剂会掩盖BCA反应变色、酶标仪就不能准确的读出吸光值，故不能变性后定量。虽然不能定量，但可以根据内参量调整上样量

试剂盒-20℃保存了影响使用吗？

请客户看一下是否有析出，如未析出则可以使用。

bca试剂盒配置的标准品母液可以在-20度存放多久？

蛋白标准溶液一年。建议分装。反复冻融会导致效价降低。

组织检测浓度比较高，怎么办？

测组织的样本，一般蛋白浓度比较高，建议根据经验稀释20-50倍检测。比如肝脏等稀释20倍以上，测试出浓度，带入标曲得到结果，再按照稀释的倍数换算过来。

整个盒子都放在-20℃冰箱保存了，现在才发现放错了，影响效果吗？

影响不大，解冻后看下是否有析出，后续请按照说明书条件保存。蛋白标准(BSA)请于2-8℃保存，配制成溶液后-20℃保存。

MA0082 缺个组分，试剂盒里只有 3 个组分；缺少蛋白标准(BSA)组分？

MA0082里面蛋白标准(BSA)发货的时候是放在外面的，不在试剂盒子里；因为需要低温，和其他组分没有在一起，麻烦检查一下保温箱以及快递包裹内部，或者联系一下代理商是否漏送了

BCA蛋白定量试剂盒里面的孵育温度只能是37℃吗，是否可以提高温度来缩短反应时间？

可以，BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。建议不超过60度，具体时间需要根据情况测试。