报告基因相关产品选择指南

报告基因系统广泛应用于真核生物基因表达和细胞生理学研究，包括受体活性、转录因子、细胞信号转导、mRNA加工和蛋白质折叠等。将目的基因与萤光素酶基因进行连接，通过底物与萤光素酶反应的生物发光，对目的基因功能性研究进行表征的现代分子生物学技术。报告基因相关产品选择指南。

meilunbio®可以为您提供各类用于报告基因相关的产品，可大致分为：单酶报告基因检测；双酶报告基因检测；报告基因质粒；其他报告基因相关。

单酶报告基因检测

概览

理论原理

报告基因系统使用一种萤光素酶。

所需仪器及主要耗材

仪器：化学发光仪或者带有化学发光功能的酶标仪
耗材：不透明平板（白色或黑色）

方法评价

操作简单方便，更适合在能够较好控制孔间差异的前提下，进行高通量筛选时使用，比如抗体活性ADCC 检测，适用于药厂等工业客户。
针对 Firefly 萤光素酶报告基因检测，美仑推出两款试剂盒：MA0517(闪光型)；MA0519(辉光型)
针对 NanoLuc 萤光素酶报告基因检测，美仑推出如下试剂盒：MA0521(辉光型)

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报告基因系统使用一种萤光素酶。操作简单方便，更适合在能够较好控制孔间差异的前提下，进行高通量筛选时使用，比如抗体活性 ADCC 检测，适用于药厂等工业客户。

针对 Firefly 萤光素酶，美仑推出两款报告基因检测试剂盒：MA0517(闪光型)、MA0519(辉光型)。针对 NanoLuc 萤光素酶，美仑推出如下试剂盒：MA0521(辉光型)。

用户可以根据实验选择的萤光素酶组合选择相应的单酶报告基因检测试剂盒。

产品	萤光素酶	底物	发光类型	发射波长 （Em:nm）	灵敏度	半衰期
MA0517	Firefly	D-luciferin	闪光型	560	高	短
MA0519	Firefly	新型 D-luciferin	辉光型	560	较高	长
MA0521	Nano	Furimazine	辉光型	460	很高	长

应用交流

美仑 MA0517-萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，是针对萤火虫萤光素酶，在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化萤光素底物（luciferin）氧化生成氧化萤光素（Oxyluciferin），在氧化过程中产生生物萤光。传统的萤光素酶检测中，酶和底物接触后，会形成快速衰减的闪光型萤光。美仑萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒（Firefly Luciferase Reporter Assay Kit）有效改善了酶促反应过程的动力学稳定性，萤光强度稳定性可达 30s 以上，并可达到至少 8 个数量级的线性检测结果。该试剂盒可灵敏高效的检测受基因元件调控的 Luciferase 表达，通常将转录调控元件或 5’启动子区克隆在 firefly luciferase 的上游，或把 3′-UTR 区克隆在 Firefly luciferase 的下游，构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞，经给药刺激等操作完毕后裂解细胞，测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等操作对目的基因的转录调控作用。萤火虫萤光素酶催化 Luciferin 发光的最强发光波长为560nm。该试剂盒为取得最佳结果，推荐使用自动进样器。

美仑 MA0519-Firefly-Glo 萤光素酶报告基因检测试剂盒是一种辉光型定量检测试剂盒，具有高灵敏度和发光信号稳定的特点，可以满足高通量检测萤光素酶在哺乳动物细胞中的表达。相对于美仑闪光型 Firefly Luciferase Reporter Assay Kit（MA0517），本品 Firefly-Glo Luciferase Reporter Assay Kit（MA0519）具有以下优点：采用了一种全新的萤光素酶检测底物，提高了发光信号的稳定性，近乎 2 小时的信号半衰期为实验设计提供了更大的灵活性；采用加样-混匀-检测的操作方法，无需依赖自动进样器，并且无需弃培养液、离心等步骤，简化了实验流程；本试剂盒组分做了大量优化，与传统闪光型产品相比，无明显刺激性气味。Firefly-Glo 萤光素酶报告基因检测试剂盒可用于多种常用细胞培养液：RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12 等，其半衰期均为 2 小时左右（22°C），满足绝大多数高通量实验需求。

美仑 Firefly-Glo 萤光素酶报告基因试剂盒（MA0519）优点：

• 稳健可靠：发光稳定，属于辉光型信号，结果重复性高；
• 方便： 试剂组成简单，直接加入到细胞共混体系进行发光验证；
• 高性价比：品质媲美进口，性价比高，适用于高通量筛选。

ADCC 效应新兴检测新方法——单萤光素酶报告基因法

目前各大制药公司逐步采用可以检测 ADCC 效应的报告基因细胞，来替代传统的依赖于 NK 细胞毒性活性的检测方法，用于抗体药物的初期筛选，大大提高筛选效率。在生物实验中，使用基因工程改造的人源 T 细胞系（效应细胞）来检测 NFAT（活化 T 细胞核因子）激活，这是 ADCC 诱导的早期信号。通过测量 NFAT 依赖的萤光素酶产生的生物发光信号，可以显示 ADCC 的诱导水平。

ADCC 效应报告基因体系使用基因工程改造的由人源 T 淋巴细胞 Jurkat 细胞（Jurkat/NFAT-luc + FcRllla）作为效应细胞，该细胞稳定表达了 FcγRIIIa 受体(V158 高亲和力同种异体)和由 NFAT 应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶。抗体在ADCC 作用机制中的生物活性通过测定 NFAT 通路活化产生的萤光素酶量，萤光素酶活性通过生物发光读数定量。检测的信号值高，且背景很低。

Jurkat/NFAT-luc + FcRllla 效应细胞已经可以用于针对不同的靶细胞（Raji、WIL2-S）和特定的单克隆抗体同种型组合进行功能测试。

常用的包含免疫检查点靶细胞如：

Raji-hCTLA4 细胞、Raji-hPD-1 细胞、Raji-hPD-L1 细胞和Raji-hTIGIT 细胞。

这四个细胞系属于 Raji（人 B 淋巴细胞）衍生靶细胞系列，这些靶细胞不仅稳定表达免疫检查点如人 CTLA-4、人 PD-1、PD-L1、TIGIT，而且表达肿瘤抗原如HER2、EGFR 和 CD20（Raji 细胞天然表达的抗原）。此外，WIL2-S 也常用做靶细胞应用到单抗检测中。具体需要根据单抗所针对的抗原来进行靶细胞选择。

单抗 ADCC 萤光素酶报告基因实验简易流程：

• ADCC 诱导：将表达表面抗原的靶细胞（WIL2-Sor Raji）与特异性单克隆抗体一起培养 1 小时，之后以适当的靶效比添加 Jurkat/NFAT-luc + FcRllla 效应细胞并培养 6 小时。其中，靶细胞和效应细胞可以自行培养，也可购买即用型直接进行孵育诱导，具体依据实验需要自行决定。
• 添加萤光素酶检测试剂（美仑 MA0519）：将检测试剂添加到上清液样品中，室温孵育。
• ADCC 测量：使用荧光读数仪检测生物发光信号，表征抗体活性。

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