产品描述
- Caspase 3/7 活性检测试剂盒(Caspase 3/7Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细 胞或组织裂解液中caspase 3/7酶活性或纯化的caspase 3/7酶活性的试剂盒。
- Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用 的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase 3，属 于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase 3和Caspase 7都可以剪切DEVD肽段序列， 因此本试剂盒可以检测caspase3/7。
- Ø本试剂盒是基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline) ，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有强吸收。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测20个样品(20T)或者100个样品（100T）。
上图为HL60细胞分为未加药组（Con）和凋亡诱导组（Apo），分别使用我公司和其他进口品牌Caspase3/7活性检测试剂盒，加入底物孵育0h, 2h, 4h, 6h, 8h至过夜，分别记录酶标仪A405nm检测结果。图中红线代表Apo组，蓝线代表Con组，绿线表示blank组。从实验结果来看，美仑组的检测灵敏度要好于进口品牌，凋亡诱导组的A405读数约为Con组3倍；而进口品牌仅为2倍，且读数低于美仑组。
- Caspase 3/7酶活性的检测：
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- 取出适量的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰浴上备用。
- 如下设置反应体系：
项目 空白对照 样品 注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μlAc-DEVD-pNA (2mM)。 检测缓冲液 40μl 40μl 待测样品 0μl 50μl 裂解液 50μl 0μl Ac-DEVD-pNA (2mM) 10μl 10μl 总体积 100ul 100ul - 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37ºC孵育60-120分钟。发 现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
- 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3/7催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
- 参考Chemicon公司的caspase 3/7酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of thecolorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37ºC under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37ºC一个小时内可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的caspase 3/7的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 3/7。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始 浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37ºC孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 3/7酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
- 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采 用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3/7的 酶活力单位。
保存条件
-20℃保存，Ac-DEVD-pNA和pNA需要避光保存。