Pemetrexed Disodium

MB2040

培美曲塞酸

MB2040-S

培美曲塞酸(标准品)

酶测定和方法:

• TS活性使用分光光度法测定，监测由于产物7,8-dihydrofolate的形成，导致的340 nm处吸光度增加。实验缓冲液包含50 mM N-tris[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸，25 mM MgC12，6.5 mM甲醛，1 mM EDTA，和75 mM 2-巯基乙醇，pH 7.4。脱氧鸟苷酸单磷酸盐，6R-MTHF，和hIS的浓度分别为100 μM，30μM 和 30 nM (1.7 milliunits/mL)。在6R-MTHF浓度下，测定未抑制的反应和6个浓度的抑制剂。Ki app值使用ENZFITTER程序通过非线性回归分析将数据拟合到Morrison方程测定。Ki值使用如下方程式计算：Ki app= Ki(1 + [S]/Km)，其中[S] 等于30 μM，Km等于 3 μM。DHFR活性通过分光光度法在340 nm下监测底物NADPH和7,8-二氢叶酸的消失测定。反应于25°C下在0.5 mL 50 mM磷酸钾缓冲液中进行，缓冲液包含150 mM KC1 和 10 nM 2-巯基乙醇，pH 7.5，和14 nM (0.34 milliunitlmL) DHFR。NADPH浓度为10 μM，而7,8-二氢叶酸的浓度在5，10，或15 μM间变化。在每个7,8-二氢叶酸的浓度下，未抑制的反应和7个抑制剂浓度被测定。使用ENZFITI’ER微机程序通过非线性回归分析将数据拟合到Morrison方程以得到Ki app值。Ki app= Ki(1 + [S]/Km)，其中[S] 等于使用的7,8-二氢叶酸的浓度，而7,8-二氢叶酸的Km等于0.15 μM。GARFT活性通过分光光度法在295 nm下监测产物5,8-dideazafolate形成导致吸光度的增加进行测定。反应溶剂包含75 mM HEPES，20% 甘油，和50 mM a-thioglygerol，pH 7.5，温度为25°C。底物和酶的浓度为10 μM α,β-甘氨酰胺核苷酸，0-10 μM 10-formyl-5,8-dideazafolic acid，和10 nM (1.9 milliunits/mL) GARFT。Ki值使用Beckman DU640分光光度计的酶作用机理程序计算，其使用非线性回归分析将数据拟合到竞争性抑制的Michaelis-Menten方程。