BX-912

BX-912是一种有效的，特异性的PDK1抑制剂，无细胞试验中IC50为12 nM，作用于PKD1比作用于PKA和PKC选择性分别高9和105倍。与 GSK3β相比，对 PDK1的选择性是600倍。

靶点

体外研究

BX912 抑制ChcK1,PKA,c-kit,和KDR，IC50分别为0.83, 0.11, 0.85, 和0.41 μM。BX912 作用于肿瘤细胞，阻断PDK1/Akt信号，在培养中也抑制多种肿瘤细胞的贴壁依赖型生长(比如PC-3细胞)或者诱导凋亡。许多癌细胞系(比如MDA-468乳腺癌)具有提高的Akt活性，在软琼脂中培养的组织对BX912的敏感性比在组织培养塑料上高30多倍, 和PDK1/Akt信号通路的细胞生存一致，这对没有粘附的细胞尤其重要。BX912 有效抑制PDK1酶活, 但是不抑制AKT2活性(IC50>10 μM)。因此, BX-912是PDK1的直接抑制剂。BX912是PDK1 活性的竞争性抑制剂，BX912 结合到PDK1的ATP结合袋中。BX912的氨基嘧啶骨架采用与PDK1激活位点相似的位点。BX912显著提高的含4 N DNA的MDA-468 细胞数, 且使细胞停在 G2/M期。BX912也有效抑制HCT-116细胞生长，按1 μM剂量处理抑制率达96%。BX912有效抑制细胞生长，IC50为0.32μM。

BX-795

MB1370

PS48

MB3972

GSK2334470

CL-11214

KP372-1(PDK1/Akt/Flt Dual Inhibitor)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.1216 mL

10.6078 mL

21.2157 mL

5 mM

0.4243 mL

2.1216 mL

4.2431 mL

10 mM

0.2122 mL

1.0608 mL

2.1216 mL

50 mM

0.0424 mL

0.2122 mL

0.4243 mL

激酶实验:

• 直接激酶法测定PDK1，耦合法测定PDK1和磷脂酰肌醇-3,4-P2调节的AKT2激活。联合实验中, 60 μL终实验混合物包括: 15 mM MOPS, pH 为7.2, 1 mg/mL牛血清白蛋白,18 mM β-甘油磷酸,0.7 mM二硫苏糖醇,3 mM EGTA,10 mM MgOAc,7.5 μM ATP,0.2 μCi[γ-33P]ATP,7.5 μM 生物素化的肽底物(生物素-ARRRDGGGAQPFRPRAATF),0.5 μL含磷脂小泡的磷脂酰肌醇3,4-P2,60 pg纯化的重组人类PDK1,及172 ng纯化的重组人类AKT2。室温下温育2小时后，生物素标签的肽段从10 μL实验混合物中转移到链酶亲和素包被的SPA珠中,在Wallac MicroBeta计数器上测定产物。形成的产物和温育时间及加入的PDK1和未激活的AKT2量相关。 加入非合适量的PDK1，用来测定AKT2抑制剂激活，及PDK1或AKT2的抑制剂BX912。测定PDK1活性, 60 μL终实验混合物包括50 mM Tris-HCl, pH 为7.5, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM EDTA, 0.1% β-巯基乙醇, 1 mg/mL BSA, 10 mM MgOAc, 10 μM ATP, 0.2 μCi[γ-33P]ATP, 7.5 μM 肽底物(H2N-ARRRGVTTKTFCGT), 60 ng 纯化的重组人类。室温下温育4小时，加入25 mM EDTA，在P81磷酸纤维素纸上染色一部分反应混合物。滤纸用0.75% 磷酸冲洗三次，用丙酮冲洗一次。烘干后，使用感光成像仪测定肽段。

细胞实验

• Cell lines:MDA-468, MDA-453
• Concentrations:0.001-1 μM
• Incubation Time:72小时
• Method:细胞系包括MDA-468,MDA-453等按每孔1.5-3×103个细胞接种在96孔板上，过夜。每孔加入溶于1% DMSO和生长培养基(DMSO最终浓度为0.1%)的10 μL BX912, 震荡处理。细胞温育72小时，加入10 μL代谢染料测定活力。在450 nm处测定WST-1信号。