AG-14361

AG14361是一种有效的PARP1抑制剂，无细胞试验中Ki为<5 nM。它比benzamides至少有效1000倍。

特性

AG14361是第一个高效的PARP-1抑制剂，具有选择性和体内活性，增强化疗和放射治疗人类癌症。

靶点

PARP1 (Cell-free assay) <5 nM(Ki)

体外研究

AG14361比Benzamides至少有效1×103倍。AG14361作用于透性化SW620细胞和完整SW620细胞时，IC50分别为29 nM 和14 nM。AG14361结合到鸡PARP-1的催化结构域的晶体分析显示AG14361三环环系统位于氨基酸残基Trp861，His862，Gly863，Tyr896，Phe897，Ala898，Lys903，Ser904，Tyr907和Glu988组成的“口袋”中。AG14361与 Ser904和Gly863形成重要氢键，与Glu988形成水介导的氢键。AG14361诱导的生长受抑制不是因为与PARP-1相关的效果，因为在比GI50浓度低很多时(≤1 μM)，也可观察到PARP-1最大抑制效果。0.4 μM AG14361不影响癌细胞基因表达或生长，但是提高 Temozolomide 和Topotecan抗增殖活性,且作用于LoVo细胞，抑制从潜在的致命γ辐射损伤中恢复，抑制达73％。此外, 0.4 μM AG14361不会大幅改变基因表达。0.4 μM AG14361处理A549细胞17小时后，不会改变6800 种基因表达。因此,虽然0.4 μM AG14361 抑制85%以上细胞PARP-1 活性，但是AG14361 不改变基因表达和细胞增殖，说明低浓度AG14361的细胞作用效果是特异性抑制 PARP-1。处于更高的抑制生长的浓度时, AG14361 影响基因表达，但是这种影响与PARP-1受抑制无关，因为在PARP-/-和PARP-1+/+细胞中，细胞增殖一样受影响。AG14361快速吸收进血流中，分布到肿瘤和肝脏中，在大脑中检测到低浓度。组织-血药浓度比显示，AG14361保留在肿瘤组织中，随着时间的推移，在两种移植瘤模型中，在体外抑制PARP-1活性所需的肿瘤浓度过剩（2小时≥15μM）。AG14361 增强Temozolomide活性，作用于全部 MMR熟练细胞(1.5-3.3倍)的活性，但是更有效作用于MMR缺陷细胞(增强3.7-5.2倍),克服 Temozolomide阻力。相反, Benzylguanine 只提高Temozolomide作用于MMR熟练细胞的效果，而作用于MMR缺陷细胞则无效果。AG14361 增强拓扑异构酶 I毒药的抑制生长作用和毒性效果。AG14361提高Camptothecin诱导DNA单链断裂的持久性。

体内研究

AG14361处理携带LoVo移植瘤的小鼠，然后进行统计学辐射，显著提高对放射疗法的敏感性。AG14361作用于移植瘤，统计学上显著提高血流，因此，可能促进药物输送到移植瘤。在体内, AG14361按无毒剂量处理，提高 Irinotecan, x射线照射, Temozolomide 诱导的 LoVo 移植瘤生长延迟，提高2到3倍。药效学实验检测， AG14361按10 mg/kg剂量腹腔注射处理SW620移植瘤至少4小时，75%以上 PARP-1活性受抑制。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

3.1212 mL

15.6060 mL

31.2120 mL

5 mM

0.6242 mL

3.1212 mL

6.2424 mL

10 mM

0.3121 mL

1.5606 mL

3.1212 mL

50 mM

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PARP-1活性检测实验:
在含 20 nM PARP-1,500 μM NAD+>及[32P]NAD+(每组反应混合物中含0.1–0.3 μCi), 和激活的小牛胸腺DNA (10 μg/mL)的反应混合物中在25oC下测量全长重组人 PARP-1的活性;加入冰冻10% (wt/vol)三氯乙酸，4分钟后，反应终止。使用 Bio-Dot微量过滤装置，使渗透进酸不溶性物质的反应产物 [32P]ADP-核糖沉淀到 Whatman GF/C 玻璃纤维过滤器上，然后使用感光成像仪量化。测定0–600 nM AG14361抑制PARP-1活性的效果，通过非线性回归分析计算AG14361作用的Ki值。

细胞实验

• Cell lines:LoVo 和SW620结肠直肠癌细胞和A549 非小细胞肺癌细胞
• Concentrations:0–20 μM
• Incubation Time:5 天
• Method:LoVo和SW620结肠直肠细胞和A549非小细胞肺癌细胞培养在含 10% 胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基上。测定在 96孔板中呈指数生长的LoVo, A549, 和SW620 细胞生长受抑制情况。使用AG14361(0–20 μM)单独处理细胞，或者和 400 μM Temozolomide联用处理细胞。培养5天后，使用10% 三氯乙酸混合细胞，然后使用sulforhodamine B对细胞进行染色。通过计算机生成曲线计算Temozolomide, Topotecan，和 AG14361单独给药或联合给药，抑制50% 生长(GI50)时的浓度

动物实验

• Animal Models:携带明显的，皮下SW620或 LoVo移植瘤的CD-1裸鼠
• Formulation:溶于DMSO，终浓度为1%
• Dosages:5 或15 mg/kg
• Administration:腹腔注射，每天一次，持续5天