Western Blot检测蛋白表达步骤及试剂配制

【原理】

一个基因表达的终极结果是产生相应的蛋白质(或酶),因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【实验步骤】

  1. 安装电泳装置,将玻璃板固定于灌胶支架上,根据待分离的蛋白质分子大小来选择所需的丙烯酰胺的百分比浓度;
  2. 分离胶的配制,按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度,一般地,5%的凝胶可用于60~200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离,10%用于16~70kDa,15%用于12~45kDa;
  3. 将分离胶缓慢倒入玻璃板的夹层中,倒入高度约占玻璃板高度的2/3即可,在分离胶液面上缓缓加入一层水饱和异丁醇(厚约1cm)。让凝胶在室温聚合30min(聚合后,可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线)。倾去顶层的异丁醇,并以1×Tris-HCl pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干;
  4. 配制浓缩胶,将浓缩胶倒入玻璃夹层中直至顶部;
  5. 选择合适的梳子插入浓缩胶中,室温放置30min,使其聚合;
  6. 蛋白质变性及点样::蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀,100°C 加热5min,使蛋白充分变性;
  7. 小心拔去梳子,以1×SDS电泳缓冲液冲洗加祥孔,并以此缓冲液充满之;
  8. 将玻璃板固定于电泳装置中,并在装置的上槽和下槽中加满1×SDS电泳缓冲液;
  9. 加样:用50µl注射器将蛋白质样品等体积加入到样品孔中,小心加样使样品在孔的底部成一薄层,对照孔加入蛋白质分子量标准样品,如有空置的加样孔,须加等体积的空白1×SDS加样缓冲液,以防相邻泳道样品的扩散;
  10. 连接电源,待溴酚蓝染料电泳到达凝胶底部为止;
  11. 关闭电源并撤去连接的导线,弃去电泳缓冲液。取出玻璃板,将其用吸水纸吸干,并做好标记,以便识别加样顺序;
  12. 小心撬起上面的玻璃板,使凝胶暴露出来。小心从下面的玻璃平板上移出凝胶,在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序,接着就可进行蛋白质的检测;
  13. 转膜:准备与胶大小相同的硝酸纤维素膜(NC膜)和六张滤纸,在电转仪上,依次放置已经在转移平衡液中平衡过的(顺序由下至上)3层滤纸、NC膜、电泳凝胶、3层滤纸,将凝胶面与负极相连,NC膜与正极相连,室温、220 V转移1 h;
  14. 清洗:将硝酸纤维素膜放入1×TBST中清洗3次,每次5分钟。摇床摇动;
  15. 封闭:转膜完毕后立即放到5%脱脂牛奶中封闭2h;(最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20(0.05 – 0.1%)稀溶液)
  16. 一抗孵育:一抗用TBST 1:200(根据自己实验)稀释,将硝酸纤维素膜放入其中,37℃孵育1.5小时(或4℃过夜),摇床摇动;
  17. 清洗:将硝酸纤维素膜放入1×TBST中清洗3次,每次5分钟;
  18. 二抗孵育:二抗用TBST 1:1000(根据自己实验)稀释,将硝酸纤
  19. 维素膜放入其中,37℃孵育1小时,摇床摇动;
  20. 清洗:用1×TBST清洗2次,每次5分钟;
  21. 显色:ECL发光显色。

【常用试剂】

  1. 储备胶(丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺):应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液,丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml,储存于棕色瓶,4℃避光保存。严格核实pH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应,使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。
  2. 注意:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
  3. 10%(w/v) SDS(十二烷基硫酸钠)溶液::0.1g SDS,1 ml H2O去离子水配制,室温保存。
  4. 分离胶缓冲液[1.5 mmol/ LTris-HCL(pH8.8)]:18.15g Tris和48ml 1mol/L HCL混合,加水稀释到100ml终体积,过滤4℃保存。
  5. 浓缩胶缓冲液[0.5mmol/L Tris-HCL(pH6.8)]:6.05g Tris溶于40ml H2O中,用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积,过滤4℃保存。
  6. 注意:这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,而不用Tris-HCL。
  7. 10%过硫酸铵(AP):过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解,故应现用现配。
  8. SDS-PAGE加样缓冲液(pH6.8): 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6.4ml,10% SDS 12.8ml,巯基乙醇3.2ml,0.05%溴酚蓝1.6ml,H₂O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在沸水中煮3min混匀后再上样,一般上样量为20-25µL,总蛋白量100µg。
  9. 10×Tris甘氨酸电泳缓冲液:30.3g Tris,188g甘氨酸,10g SDS,用蒸馏水溶解至1000ml,得0.25 mol/L Tris-1.92 mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
  10. 转移缓冲液:配制1L转移缓冲液,需称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris碱、0.37g SDS,并加入200ml甲醇,加水至总量1L。
  11. 10×TBST缓冲液:250 mM Tris-HCl (pH 8.0),1.25 M NaCl, 0.5% Tween-20。
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