VX-809 (Lumacaftor)

VX-809通过促进突变型CFTR(F508del-CFTR)的成熟，从而纠正常见于囊性纤维化的CFTR突变，EC50为0.1 μM。

靶点

CFTR

IC50

0.1 μM

体外研究

VX-809在雌激素受体（ER）水平上起作用的行为，使一部分F508del-CFTR采取正确折叠的方式，退出ER，转移到细胞表面，正常起作用。VX-809作用于表达F508del-CFTR的Fischer大鼠甲状腺(FRT)细胞, VX-809显著提高F508del-CFTR突变，提高7.1倍，EC50为0.1 μM,且增强F508del-CFTR调节的氯离子运输，提高5倍，EC50为0.5 μM,而VRT-768作用时具有更高的EC50值，EC50分别为7.9 μM和16 μM。VX-809 (3 μM)作用于表达F508del-CFTR的HEK-293细胞,提高ER中的F508del-CFTR，提高6倍。VX-809作用于携带F508del-CFTR突变的原代人支气管上皮(HBE)细胞，提高CFTR成熟度，且增强氯离子分泌，EC50分别为350 nM和81 nM,比Corr-4a和VRT-325更有效。VX-809修正的F508del-CFTR具有单通道开发概率，为0.39，与正常CFTR类似，正常CFTR为0.40。与VX-770不同, VX-809不是CFTR增强剂，急剧加入VX-809不会对F508del-CFTR功能造成影响。与VRT-325和Corr-4a相反, VX-809不会促进正常或突变形式hERG或P-gp的进程,及其他疾病引起错误定位的蛋白质，包括α1-抗胰蛋白酶Z突变(E342K-α1-AT)或N370S-β-葡萄糖苷酶,说明VX-809特异性作用于CFTR。

特征

在纠正CFTR缺陷方面，VX-809比之前报道的药物特异性更强，且更有效。

CFTRinh-172

MB3808

VX-661

MB3809

依伐卡托(IVACAFTOR)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.2104 mL

11.0519 mL

22.1038 mL

5 mM

0.4421 mL

2.2104 mL

4.4208 mL

10 mM

0.2210 mL

1.1052 mL

2.2104 mL

50 mM

0.0442 mL

0.2210 mL

0.4421 mL

F508del-CFTR成熟度:
用浓度不断增高的VX-809处理稳定表达F508del-CFTR的Fischer大鼠甲状腺(FRT)细胞48小时。温育后，细胞收集在冰冻D-PBS溶液中 (没有钙和镁)，然后按1,000 × g 转速在4oC下离心。细胞颗粒溶解1% Nonidet P-40, 0.5%去氧胆酸钠，200 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.8, 及 1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物中(1:250)，然后在冰上放置30分钟。裂解物在10,000×g转速4oC下旋转10分钟，将细胞核和不溶性物质制成颗粒状。12 μg 全部蛋白在Laemmli buffer 中与5% β-巯基乙醇在37oC加热5分钟，然后上样到3% 到8% Tris-乙酸凝胶上。凝胶转移到硝化纤维素中，使用单克隆CFTR抗体或 GAPDH多克隆抗体进行 Western blotting。通过增强发光而进行印迹。通过扫描片的 NIH ImageJ 分析而而测量C带和GAPDH的相对量。

细胞实验：

• Cell lines:FRT(CFTR 或 F508del-CFTR), HEK-293 (CFTT 或 F508del-CFTR), 和HBE
• Concentrations:溶于DMSO, 终浓度为~0.1 mM
• Incubation Time:24 或 48 小时
• Method:使用浓度不断增高的VX-809处理细胞24或48小时。使用Ussing chamber技术记录 CFTR介导氯离子运输中的跨膜电流 (IT)结果。通过使用离体的内面外向式膜片钳测量CFTR单通道活性。使用单克隆CFTR 抗体及免疫印迹技术测量表达CFTR或F508del-CFTR的FRT, HEK-293, 或 HBE细胞中CFTR成熟度。