G418硫酸盐,遗传霉素

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G418硫酸盐;遗传霉素;G-418 disulfate,Geneticin
分子式:C20H40N4O10.2(H2SO4) 分子量:692.70

简介:遗传霉素硫酸盐G-418 disulfate 是一种氨基糖苷类抗生素,与 gentamicin B1 的结构相似,在原核和真核细胞的蛋白质合成过程中,能够阻止蛋白质的延伸阶段,从而抑制蛋白质的合成。

别名:Geneticin sulfate; Antibiotic G-418 sulfate;D-Streptamine, O-2-amino-2,7-dideoxy-D-glycero-α-D-gluco-heptopyranosyl-(1—>4)-O-[3-deoxy-4-Cmethyl-3-(methylamino)-β-L-arabinopyranosyl-(1—>6)]-2-deoxy-, sulfate (1:2)
物理性状及指标:
外观:……………………白色粉末
溶解性:…………………Water 50 mg/mL warmed;DMSO Insoluble;Ethanol Insoluble
干燥失重:………………≤8.0%
效价:……………………>500U/mg,
储存条件:2-8℃,避光防潮密闭干燥

运输条件:常温运输

生物活性

产品描述

Geneticin (G418 Sulfate), 一种氨基糖苷类抗生素, 是80 S ribosomes延伸的抑制剂,在原核和真核细胞中均能通过抑制延伸步骤来阻断多肽合成。

体外研究

G418浓度为1-300 microgram/ml时,抑制多种原核和真核生物。来自Tn5(编码氨基糖苷3′-磷酸转移酶,APT 3′ II)的neo基因赋予G418抗性,通常用在实验室研究中用于筛选基因工程细胞。一般作用于细菌和藻类的浓度为5 mg/L或更低,筛选哺乳动物细胞的浓度为400 mg/L,维持哺乳动物细胞的浓度为200 mg/L。筛选耐药株可能需要1周到长达3周。

体内研究

40 到 80 mg/kg剂量的G418连续处理三天,足以消除所有来自感染小鼠的未转染的T. brucei brucei寄生虫。

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G418硫酸盐,遗传霉素

G-418 disulfate,Geneticin

用途及描述:科研试剂,广泛应用于分子生物学,药理学等科研方面,严禁用于人体。 Geneticin硫酸(G418)是一种氨基糖苷类抗生素,抑制氨基酸形成蛋白质和破坏成纤维细胞。本品影响80S核糖体,抑制周期延长。进一步的研究表明,本品对变形虫,原生动物,绦虫具有高度活性。在使用带有NeoR筛选标记的载体DNA转染真核细胞时,向培养基加入G418可以杀死没有被转染的细胞,筛选出阳性转染细胞,建立稳定细胞系。G418可以在10到14天时间内筛选出稳定细胞系。本品不能用于临床。
储液配置:

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.4436 mL

7.2180 mL

14.4361 mL

5 mM

0.2887 mL

1.4436 mL

2.8872 mL

10 mM

0.1444 mL

0.7218 mL

1.4436 mL

50 mM

0.0289 mL

0.1444 mL

0.2887 mL

使用方法推荐:请参考溶解度信息来选择合适的溶剂。仅供参考。
1.G418储存液的配制(50 mg/mL,活性浓度)
1)活力单位的换算:根据此公式进行换算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而异。可见批次对应的质检报告,或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
比如若所用批次的G418 活力值为:500 µg/mg,要配制50 mg/mL的G418活性浓度,则实际要配制的粉末浓度为1000/500×50 mg/mL=100 mg/mL。
2)除菌和保存根据上述换算得到的实际粉末称重量,加入10 mL无菌去离子水内使其完全溶解。之后使用此滤器过滤,除菌后分装成单次使用的小量放到-20℃冻存,1年稳定。
【注】:①不要对混浊的溶液进行过滤,因为混浊的溶液意味着未完全溶解,过滤过程中会造成药物损失,降低终液的活性。②不建议使用液体培养基,NaCl,磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液。
2.常用筛选浓度
一般来说,刚开始筛选转化子需要高浓度的G418,并用一个较低浓度的G418用于维持培养。生长条件,细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量,因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线(kill curve),即剂量反应性曲线,来确定最佳筛选浓度。
通常情况,哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL;植物细胞:10-100 μg/mL;酵母细胞:500-1000 μg/mL;以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度,可做参考。

细胞类型

激活浓度

应用

网柄菌属

a) 10 μg/mL
b) 30 μg/mL

a)培养在培养液中;
b)培养在冻干细菌上;

哺乳动物

a) 400 -1000 μg/mL
b) 200 μg/mL

a)用于筛选
b)用于维持生长

植物

a) 25-50 μg/mL
b) 10 μg/mL

a)用于筛选
b)用于维持生长

酵母

a) 500 μg/mL
b) 125-200 μg/mL

a)用于筛选
b)用于维持生长

细菌

8-16 μg/mL

用于筛选

3.杀灭曲线的建立
【注】:为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度,可通过建立杀灭曲线(剂量反应曲线)来实现,至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强,因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。
1) 第一天:未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上,37℃,CO2培养过夜;
【注】:对于需要更高密度来检测活力的细胞,可增加接种量。
2) 根据细胞类型,设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定0,50,100,200,400,800,1000 μg/mL。
3) 第二天:去除旧的培养基,换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。
4) 接下来每3-4天更换新的含药物培养基。
5) 按照固定的周期(如每2天)进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数(通常是7-10天)内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。
4.稳定转染细胞的筛选
1) 转染48 h后,用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞(直接传代或者稀释后传代)。
【注】:细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密,其效率会降低。为了得到较好的筛选效果,最好将细胞稀释至丰度不超过25%。
2) 每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。
3) 筛选7天后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间,这取决于宿主细胞类型,转染,以及筛选效果。
4) 挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板,继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。
5) 之后更换正常培养基培养即可。
注意事项
1)本品不可高压灭菌;
2)G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂(如青霉素/链霉素)共同使用,因为它们是G418的竞争性抑制剂。其他的抗生素也会产生交叉活性。
3)配制G418溶液时,一定要根据G418批次不同的活力值(potency)来进行换算,从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
4)G418加入培养体系中未转染的细胞有可能不会被杀死,原因在于药物浓度过低,或者细胞密度过高。另外,快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞,更容易被杀死。对照细胞(未转染)可能抗生素添加5-7天后才能杀死,转染细胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。
5)即使加入杀死剂量的G418,细胞可能会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。
体外实验配制方法:

  1. 先将使用到的所有器具去除内毒素和其它污染源,仪器表面、工作台面消毒。
  2. 在分析天平上称取G418粉末1.00 g,加20 mL 无菌水溶液溶解。
  3. 用专用的超滤滤膜过滤到去除内毒素的容器中,然后分装到 1.5 mL EP管中。
  4. 不建议使用螺旋盖管子,容易污染。-20度保存,避光。
  5. 为避免污染和失效,建议分装成小规格的,如500 uL。

体内实验配制方法:将生理盐水加入产品,现配现用:30 mg/mL
动物实验举例(来自公开的文献,美仑生物并不保证其有效性):
Animal Models: 血液中含T. bruceibruceiGUTat 3.1和 T. bruceibruceiGUTat 3.1/BBR3的亚致死量辐射的小鼠
Formulation: 溶于无菌水
Dosages: 10, 20, 30, 40, 50, 或 80 mg/kg
Administration: 腹腔注射

【注意】
●我司产品为非无菌包装,若用于细胞培养,请提前做预处理,除去热原细菌,否则会导致染菌。
●部分产品我司仅能提供部分信息,我司不保证所提供信息的权威性,以上数据仅供参考交流研究之用。

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参考文献
[1] Davies J, et al. Am J Trop Med Hyg, 1980, 29(5 Suppl), 1089-1092

[2] Li Y, et al. World J Gastroenterol, 2003, 9(10), 2174-2177.
[3] Murphy NB, et al. Antimicrob Agents Chemother, 1993, 37(5):1167-70.

规格

100mg, 1g, 5g

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