蛋白荧光标记产品选择指南

蛋白标记荧光染料

理论原理

荧光探针可以被修饰成NHS酯（N-羟基琥珀酰亚胺 酯），它是最常见的氨基反应活性酯。由于氨基在蛋白质和多肽中极为常见，因此氨基修饰是生物大分子修饰中最为常见的一种。其它含有氨基的寡聚核苷酸、 DNA、糖类也可以通过氨基修饰来标记上荧光探针等基团。

所需仪器及主要耗材

建议配置： 荧光显微镜或激光共聚焦荧光显微镜，配备相关波段光源及滤光组；或者满足相应激发发射波段的流式细胞仪。此外具有荧光功能的酶标仪也可以进行检测。

耗材 载玻片；盖玻片；共聚焦专用培养皿；载波片；封片剂；灭菌枪头；流式检测管；96 孔板等。

常见分类	方法评价
经典染料(荧光素系列、罗丹明系列等)	常规荧光染料荧光信号强，使用范围广,光谱波段可以匹配当下主流仪器，很多仪器都有预设参数如：FITC、罗丹明等；缺点是荧光稳定性略差如 FITC。
花青素Cy 系列染料	花青素类荧光染料水溶性相对较好，涵盖常见波长范围。长波段的 Cy5, Cy5.5, Cy7 等染料较为常用，由于荧光透过性好，适用于活体成像。
新型 Alexa Fluor 系列染料	Alexa Fluor 系列是相对较新的荧光染料，水溶性 好，可供选择的波长范围 广（涵盖从紫外到红外波段 Alexa Fluor 405-790nm），用户选择更加灵活，而且荧光稳定性有了很大程度的提升。
荧光蛋白系列（APC、PerCP、PE 及其衍生物）	荧光蛋白标记物与荧光化学探针相比，稳定性略差，但量子产率高（如 PE），一般适用于生物样本的追踪。他们本身不能与目标标记物偶联，需要偶联剂介导交联反应。
其他染料	本目录下的其他染料主要有： 1.非荧光标记类探针，包括：活性探针前体、标准品等，如：MB12193_CY5、MB12196_CY7。 2.具有特殊用途，比如检测蛋白水解酶活MB3124_7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。 3.原位细胞染色类探针，利用了探针衍生物与蛋白或者核酸结合的特性，进一步巩固探针在细胞内的定位，如MB4830_5-CFDA。 用户在选用上注意区分。

蛋白标记试剂盒

理论原理

经过修饰的荧光染料如 NHS酯类荧光染料可以与目标蛋白质上的氨基，巯基，咪唑基，酪氨酰基和羰基发生交联反应。再利用微型离心
纯化柱去除多余的染料即可得到荧光标记的目标蛋白。

所需仪器及主要耗材

仪器：离心机，紫外分光光度计，荧光显微镜等。
耗材：试剂盒内提供。

常见分类	方法评价
按照标记荧光染料的荧光波段进行分类	本品采用装填有纯化树脂的微型离心柱进行反应后荧光染料去除方法，可以简化常规过柱 平衡、收集和监测重力流分的步骤。从而实现对目标蛋白的快速荧光标记。 对比传统方法更加方便、省时、使用范围广、产物稳定等优势。

meilunbio®蛋白标记荧光染料产品介绍

荧光标记是将荧光基团共价连接到另一个分子上的过程，如蛋白质或核酸。这通常是通过使用荧光基团的活性衍生物来实现的，它可以选择性地与目标分子中的官能团结合。最常见的标记分子是抗体，然后用作检测特定目标的特定探针。荧光标记可应用于各种检测系统，并允许敏感和定量测量。

应用交流：
荧光探针的化学反应衍生物是标记分子所必需的。常见的反应基团包括胺-反应的异硫氰酸酯衍生物，如 FITC；胺-反应的琥珀酰亚胺酯，如 NHS -荧光素或 Alexa Fluor系列 NHS 酯，花青素 Cy 系列 NHS 酯等。任何一种活性染料与另一种分子发生反应，都会在荧光团和标记分子之间形成稳定的共价键。异硫氰酸酯及其衍生物长期以来一直被用于与蛋白质的赖氨酸侧链连接反应。氨酯化学目前是首选的标记方法，因为它对初级胺有更大的特异性，并在标记过程中产生更稳定的连接。

NHS 酯（N-羟基琥珀酰亚胺酯）是最常见的氨基反应活性酯。由于氨基在蛋白质和多肽中极为常见，因此氨基修饰是生物大分子修饰中最为常见的一种。其它含有氨基的寡聚核苷酸、DNA、糖类也可以通过氨基修饰来标记上荧光探针等基团。与 FITC相比，在其他亲核试剂存在的情况下，NHS -酯衍生物对初级胺有更大的特异性，并在标记后形成更稳定的连接产物，同时不干扰分子的正常生物学特性，包括功能、溶解度、结合能力或激活特性。

NHS 酯与氨基反应对 pH 值非常敏感，过低或过高的 pH 值都会影响反应效果：低pH 时，氨基是质子化的无法修饰；高 pH 时 NHS 酯水解过快修饰效率大大降低；最佳的修饰反应 pH 值在 8.3 到 8.5 之间。修饰反应通常在水中进行，如果 NHS 酯连接的功能团不易溶于水，可以加入 DMSO 和 DMF 助溶，但要注意 pH 值应调节在 8.3-8.5，同时要避免溶液中含有氨基。

在荧光标记反应之后，通常需要从标记的目标分子中去除未反应的荧光基团。利用荧光基团与标记蛋白、核酸等之间的大小差异，通常通过凝胶柱层析来实现。然而，许多荧光团与典型的分离基质相互作用，导致回收率和分离效果不佳。因此，可以首选使用商业化的染料去除柱，如微型离心式凝胶柱，参考 MA0362，可以从小至 7kDa大至 IgG (150 kDa)的蛋白质中去除染料分子，简单快速高效地获取荧光标记产物。

meilunbio®蛋白标记试剂盒

meilunbio®蛋白标记试剂盒为将荧光标记物偶联至蛋白（抗体）上提供了一种方便的方法。荧光探针偶联物是多种应用的理想选择，包括流式细胞术、荧光显微镜、免疫组织化学、ELISA、免疫细胞化学、FISH 等。试剂盒有 12 种 Alexa Fluor®染料颜色、荧光素 EX 和德州红色®染料。每个试剂盒提供三次蛋白接合和纯化所需的成分。

meilunbio®快速 FITC 抗体（蛋白）标记试剂盒 (Quick FITC Antibody(protein)Labeling Kit)包含蛋白质标记染料和去除多余染料所需的全部组分。异硫氰酸荧光素（FITC）可以与蛋白质上的氨基，巯基，咪唑基，酪氨酰基和羰基发生交联反应。然而，只有伯胺和仲胺的衍生物才能产生稳定的标记产物。反应在 pH 8-9 下效率最高，并且必须在无胺缓冲液如硼酸盐或碳酸盐/碳酸氢盐中进行。通常，蛋白质与 15 至 20
倍摩尔数的 FITC 反应，可导致几个 FITC 分子与一个蛋白质分子结合。装填有纯化树脂的离心柱简化了柱平衡、收集和监测重力流分的步骤。该系统能够有效去除多余的FITC，从而准确测定染料与蛋白的比例（F/P）和蛋白浓度。

应用交流：meilunbio®快速 FITC 抗体(蛋白)标记试剂盒具有以下特点：
1.方便：标记少量(<1mg)纯化蛋白质或抗体。
2.省时：蛋白质标记准备工作在 2 小时内完成，需要大约 30 分钟的实际操作时间；
3.使用范围广：蛋白质分子量 12 到 150 kDa,包括免疫球蛋白抗体(~ 150 kDa)。
4.可靠：荧光标记的蛋白质偶联物在一定时间内相对稳定。